铝佐剂在重组蛋白疫苗处方开发中的考虑点（一）中介绍了氢氧化铝和磷酸铝结构、剂量和吸附相关内容。本次将介绍铝佐剂本身稳定性、制剂处方、体外检测及体内消除方面的考虑。

1. 佐剂本身的稳定性

1.1  老化

结晶性固体的有序度以WHH表征。表1显示了在室温下放置稳定性的两个氢氧化铝佐剂样品(原样品：10.6 mg Al/mL；水稀释样品：1.7 mg Al/mL。)的有序度的变化。两种氢氧化铝佐剂样品的WHH在老化过程中都有所下降，表明佐剂变得更加有序。老化过程中WHH的降低伴随着pH的降低，且铝佐剂的吸附能力变弱。

表1 室温老化对两种氢氧化铝佐剂性能的影响

将含有4.4mg Al/mL且P/Al摩尔比为1.0的磷酸铝佐剂在室温下放置15个月。佐剂最初和在15个月X射线都是无定形的。然而，随着pH值的降低，老化过程中出现了有序性，表明形成了双氢氧化物桥，溶菌酶吸附能力下降（表2）。

表2  室温老化对P/AI摩尔比为1.0的磷酸铝佐剂性能的影响

1.2  高压灭菌

氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂在高压灭菌过程中都表现有序度增加，导致蛋白质吸附能力下降。应选择暴露在高温下的时间最小化的高压灭菌条件。应避免对相同样品进行重复高压灭菌的程序。

1.3  冷冻

当含铝佐剂疫苗被冷冻时，其物理特性和免疫特性可能会受到不利影响。在一项研究中，六个实验室研究了冷冻白喉、百日咳、破伤风（DPT）疫苗后的表现。结果表明八种吸附疫苗中，有六种表现出不可逆的物理变化，包括颗粒物的出现和沉积速率的增加。疫苗效力方面，三种疫苗的百日咳效力下降，两种疫苗的破伤风效力下降，但在白喉的两种疫苗中没有观察到变化。尽管有些吸附百白破疫苗没有显示出效力下降或毒性增加，但仍建议丢弃冷冻的吸附疫苗。

除了含铝佐剂的物理变化外，冷冻还可能导致蛋白质抗原的二级、三级或四级结构甚至碎片化的变化。总之，如果铝佐剂疫苗暴露在冷冻条件下，则不应使用。

2. 疫苗的处方考虑

2.1  缓冲溶液的选择

配制疫苗时应考虑缓冲物质与含铝佐剂的潜在相互作用。需要特别考虑两种缓冲体系：磷酸盐和柠檬酸盐。磷酸根阴离子通过配体交换被氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂吸附。作为缓冲液，存在于疫苗制剂中的磷酸根阴离子的吸附可以通过影响表面电荷和可用于与抗原的磷酸基团进行配体交换的表面羟基的数量来影响抗原的吸附。柠檬酸盐阴离子是一种α-羟基羧酸，它吸附在含铝的佐剂上，并通过形成可溶性铝-柠檬酸盐络合物来溶解铝。不会改变含铝佐剂性质的缓冲液是醋酸盐和TRIS。

然而，只要了解磷酸盐缓冲液对含铝佐剂的影响，就可以使用磷酸盐缓冲液。例如，当用磷酸盐缓冲液配制疫苗时，疟疾抗原R32tet32的吸附增强，R32tet32的等电点为12.8，理论上应被氢氧化铝佐剂静电排斥。然而，当磷酸盐缓冲液的浓度从3 mM增加到20 mM时，R32tet32的吸附增加。原因是缓冲液的磷酸根离子吸附到氢氧化铝佐剂上，降低了等电点，如图1所示。降低氢氧化铝佐剂的等电点导致R32tet32和佐剂之间产生静电吸引力。

磷酸盐缓冲液的使用也可以减少抗原的吸附。重组保护性抗原的等电点为5.6，并被氢氧化铝佐剂静电吸附。图2显示，与水相比，当用Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水配制时，重组保护性抗原的吸附能力降低。吸附能力的降低可能是由于磷酸根阴离子的吸附导致氢氧化铝助剂的等电点降低，以及降低静电力的离子强度增加所致。

图 2 重组保护性抗原和氢氧化铝佐剂在pH 7.4、25°C下的吸附等温线；在水中（◆）和Dulbeccos磷酸盐缓冲液中（■）

2.2  pH

吸附在含铝佐剂上的抗原可能暴露在与本体pH不同的pH下，尤其是当佐剂具有表面电荷时。最近的一项研究使用葡萄糖-1-磷酸作为模型抗原来研究氢氧化铝佐剂的微环境pH。葡萄糖-1-磷酸通过磷酸基团的配体交换而强烈地吸附在氢氧化铝佐剂上。在pH 5.4下，吸附在带正电荷的氢氧化铝佐剂上的葡萄糖-1-磷酸的水解速率显著慢于在相同pH下葡萄糖-1-磷酸溶液的水解速率。带正电荷佐剂静电吸引阴离子以产生高于5.4的微环境pH，从而降低酸催化水解的速率。在pH 5.4下吸附的葡萄糖-1-磷酸以与在pH 7.3下葡萄糖-1-磷酸的溶液相同的速率水解。因此，得出结论，氢氧化铝佐剂的微环境pH比本体pH高约2个pH单位。

通过pH依赖性机制降解的抗原的化学稳定性可以通过改变含铝佐剂的表面电荷，以在佐剂的微环境中产生最大稳定性的pH来优化。

2.3  含量均匀度

在分装悬浮液时，获得准确的剂量始终是一个问题。这也是疫苗生产的一个问题，因为大多数抗原的剂量是微克，而含铝佐剂的量可能高达每剂0.85毫克铝。含铝佐剂以大约50nm的初级颗粒的形式存在，这种小颗粒的高表面自由能导致它们聚集，最终形成2至20μm的聚集体。但是，聚集体在搅拌（Mixing）时易于分散，因此，只要充分的搅拌（Mixing），就有利于抗原的均匀分布。虽然在搅拌停止时铝佐剂还是会重新聚集。

3. 抗原的解吸附

疫苗制剂中，可能需要解吸附抗原，以直接测定吸附抗原的量或检查抗原的构象。

表面活性剂可以使蛋白从铝佐剂表面洗脱，一项研究筛选了一系列阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，以确定其从氢氧化铝佐剂中洗脱卵清蛋白或从磷酸铝佐剂中洗脱溶菌酶的能力。所研究的表面活性剂为Triton X-100和十二烷基麦芽糖苷（非离子）、十二烷基磺基甜菜碱（两性离子）、12烷基硫酸钠（阴离子）、十六烷基氯化吡啶和十二烷基三甲基氯化铵（阳离子）。氯化十六烷基吡啶从氢氧化铝佐剂中产生最大程度的卵清蛋白洗脱（60%）。十二烷基硫酸钠从磷酸铝佐剂中完全洗脱溶菌酶。表面活性剂洗脱卵清蛋白或溶菌酶的有效性与其使蛋白质变性的能力直接相关。因此，使用表面活性剂洗脱抗原的缺点是可能使抗原变性。

在疫苗的体外测试期间洗脱抗原的另一种方法是溶解含铝佐剂。溶解可以通过调节pH、加入柠檬酸根阴离子或柠檬酸根离子与pH的组合来实现。氢氧化铝佐剂的最小溶解度pH为5.0。当pH调节到低于4.1或高于7.4的值时，观察到卵清蛋白的洗脱。在pH2.9或11.0时观察到最大洗脱。这种洗脱可以通过氢氧化铝佐剂的溶解来解释。α-羟基羧酸，如柠檬酸、乳酸或苹果酸，由于形成稳定的五元或六元环，是金属离子的良好螯合剂。众所周知，柠檬酸根阴离子对含铝矿物具有增溶作用。Seeber等人证明了氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂可以在pH 7.4下被柠檬酸钠溶液溶解。磷酸铝佐剂明显比氢氧化铝佐剂更易溶解。

如果抗原的性质允许，通过溶解佐剂洗脱抗原的最佳方法是将低pH下的溶解与通过与柠檬酸盐阴离子螯合的溶解相结合。因此，将疫苗暴露于调节至pH 4的柠檬酸钠溶液通常是洗脱抗原的有效技术。

通过静电吸引吸附的抗原可以通过逆转含铝佐剂的表面电荷来洗脱。例如，在pH 7.4下，静电引力在氢氧化铝佐剂（等电点11.4）对卵清蛋白（等电点5.0）的吸附中起作用。4mM磷酸根阴离子的加入导致45%的吸附卵清蛋白被洗脱。向氢氧化铝佐剂中加入4mM磷酸根阴离子导致等电点从11.4变为6.7。因此，氢氧化铝佐剂的表面电荷变为负，并且排斥静电力在卵清蛋白和佐剂之间作用。
4. 铝佐剂的体内消除

间质液体含有显著浓度的柠檬酸、乳酸和苹果酸，这些α-羟基羧酸能够螯合铝并溶解含铝化合物。使用pH 7.4的柠檬酸盐溶液进行体外溶出度研究，模拟间隙液中的α-羟基羧酸，氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂都能溶解，无定形磷酸铝佐剂更容易溶解。因此，含铝佐剂很可能溶解在间质液体中，铝在淋巴中被输送到血液中，在血液中被肾脏排出。机体消除含铝佐剂的能力可能是其良好安全记录的部分原因。

参考文献

[1] Aluminum-Containing Adjuvants: Properties, Formulation, and Use. Vaccine Adjuvants and Delivery Systems. 2006.