1、铝佐剂

重组亚单位抗原通常没有足够的免疫原性，所以通常在疫苗配方中使用佐剂来提高免疫原性。铝佐剂是人类疫苗中使用最广泛的佐剂，通过在注射部位创造局部炎症环境来激活先天免疫细胞的抗体产生。常用的两种铝佐剂是氢氧化铝(AH)和磷酸铝(AP)。AH是化学结晶的羟基氧化铝，等电点（IEP）为11.4，中性pH值下表面带正电荷。AP呈非结晶态，等电点在4.6-5.6，中性pH值下表面带负电荷。

1.1、氢氧化铝

氢氧化铝佐剂的X-射线衍射图如图1所示。两种主要形式的氢氧化铝[Al(OH)3]的x射线衍射图也如图 1所示。

氢氧化铝佐剂的X射线衍射图与氢氧化铝有显著差异。因此，氢氧化铝佐剂并不像其名称所暗示的那样在化学上是Al(OH)3。氢氧化铝佐剂在12.6、27.5、38.2、48.4和64.4°2θ下的宽反射对应6.46、3.18、2.35、1.86和1.44Å的d-间距。这些d-间距确定氢氧化铝佐剂为结晶性差的勃姆石（boehmite），一种形式为AlO(OH)的氢氧化铝。结晶性差的勃姆石在工业应用中被广泛用作吸附剂或催化剂。初级的氢氧化铝颗粒形成松散的、不规则的聚合体，聚合体大小在1-10μm之间，这些聚合体很容易被剪切力分开，但是剪切力消失时又会重新形成。

小的初级颗粒是使用结晶性差的勃姆石作为吸附剂的原因。传统测量表面积的技术要求样品完全干燥，干燥过程导致小的初级颗粒不可逆地聚合。因此，传统技术低估了氢氧化铝佐剂的表面积。用重力傅立叶变换红外分光光度计测定了氢氧化铝佐剂的表面积，测定的表面积约为500 m2/g，如此高的表面积对于结晶材料来说是不寻常的。

氢氧化铝佐剂在水性介质中表现出非常低的溶解度，但在酸性或碱性介质中溶解度增加（图2）。

氢氧化铝佐剂的吸附性能与表面积和表面基团有关。表面由与铝配位的羟基组成（图 3）。这种羟基被称为金属羟基，可以接受质子产生正位点，也可以提供质子在表面产生负位点。因此，氢氧化铝佐剂的表面电荷取决于pH。氢氧化铝佐剂的等电点为11.4（图 4）。氢氧化铝佐剂表面的羟基可以被磷酸或氟离子取代，这一过程被称为配体交换，是磷酸化抗原的重要吸附机制。

图3.  氢氧化铝(a)和磷酸铝(b)表面示意图

1.2、磷酸铝

磷酸铝佐剂对X射线是无定形的，因此无法通过X射线衍射进行鉴定。FTIR光谱显示氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂的表面示意图如图3所示。FTIR显示，磷酸铝佐剂在1100 cm-1处具有吸收带，这是磷酸盐的特征；当样品加热到200°C时，在3164 cm-1处有一个明显的带，这是结构羟基的特征。因此，磷酸铝佐剂是化学上无定形的羟基磷酸铝，而不是AlPO4。羟基磷酸铝不是化学计量的化合物，羟基和磷酸盐的组成取决于沉淀反应物和条件。

磷酸铝等电点与P/Al摩尔比成反比（图5）。通常，磷酸铝佐剂的等电点在4.6-5.6。磷酸铝佐剂比氢氧化铝佐剂更易溶解，与氢氧化铝佐剂一样，它在酸性或碱性介质中更易溶解（图6）。

图 5. 磷酸取代羟基对磷酸铝佐剂等电点的影响

图 6. 磷酸铝在不同pH溶液中45min后的溶解度（误差条表示95%的置信区间）

2、铝佐剂剂量

根据《预防用含铝佐剂疫苗技术指导原则》，国际上采用法规或通则的形式明确提出了铝佐剂的安全性限度标准，均以铝离子含量为单位计，世界卫生组织及欧盟为不高于1.25mg /剂，美国要求为不高于0.85mg/剂。而目前上市疫苗铝佐剂多为0.3-0.5mg/剂，个别疫苗采用的0.85mg/剂是上市疫苗使用铝佐剂的最高剂量。在我国药典的各论中，多个疫苗均以氢氧化铝含量计算，为0.35-3.0mg/ml，该标准以已上市疫苗铝佐剂含量范围拟定。如疫苗需使用铝佐剂，需参考国际通用的铝佐剂上限要求、已上市疫苗大规模人群使用经验（普遍选用不超过0.5mg/剂）等，上述备选参考剂量只是一个推荐的参考范围，针对具体疫苗及其适用的最优剂量，还需要通过必要的临床前研究和临床研究筛选确定，以求能够达到预期目的的最小使用剂量。既往同类品种铝佐剂使用信息可作为铝佐剂添加的依据。

3、抗原与铝佐剂的相互作用研究

一些研究表明，注射前抗原吸附到无机颗粒上是铝盐“佐剂效应”的关键因素，铝盐可促进抗原呈递细胞（APC）吸收抗原。但是其他研究表明，仅AH的存在就可以诱导免疫增强，并且不需要将抗原吸附到AH上并保留在注射部位。然而，自1977年以来，世界卫生组织一直建议，在含有铝佐剂的疫苗中，抗原吸附应最大化80%。

AH和AP都是胶体悬浮液，可以通过多种分子机制吸附蛋白质抗原，包括静电、疏水和配体交换相互作用。例如，某带负电的抗原（pI~5.9）可100%与AH结合，但亦可与AP不完全结合，可能是由非静电力驱动的，如疏水相互作用。

用不同浓度的磷酸钠预处理AH，磷酸盐与铝盐表面羟基的会发生配体交换，将佐剂的总表面电荷从正变为负。用0、20和200 mM磷酸钠预处理AH，AH表面电荷（ζ电位）从正（~+28 mV）改为负(~ -20 mV至~- 30mV）。一项研究中，添加相同量的磷酸钠0、20、200mM，抗原与AH结合的百分比分别从约100%、约40%和约10%降低。然而，磷酸盐浓度>200mM也没有进一步影响抗原从AH的解吸（数据未展示）。

Langmuir吸附等温线-结合等温线可以用于计算AH结合抗原的吸附容量（Qmax）和结合强度（KL）值。将不同量的抗原与固定量的AH孵育吸附。然后将样品离心，通过紫外可见光谱法测量上清液蛋白浓度（Ce），然后对数据进行分析，以拟合Langmuir方程的线性化形式，从而计算Qmax和KL。

Langmuir方程

Langmuir方程线性化形式如下, 其中qe和Ce分别为固相和液相平衡浓度。Qmax是最大（单层）结合能力。KL表示Langmuir等温线常数，表示结合强度。

下图展示了在某抗原~1.7 mg /mg AH下的单层吸附。抗原-佐剂相互作用的吸附强度（KL）值测量为~320 mL/mg，是一个相对较高的值。

4、吸附的后热稳定性

关于铝佐剂在多大程度上保护或破坏抗原稳定，存在相互矛盾的理论。即吸附后有可能使蛋白更稳定，也有可能更不稳定，蛋白质稳定性可能受到结构变化的影响。可以通过比较吸附与未吸附抗原的DSC结果来初步判断。以下为三种重组蛋白疫苗在含/不含氢氧化铝溶液中时的Tm值比较。

5、总结

佐剂不仅影响免疫原性，对配制抗原的药物特性和储存稳定性亦有影响。为此，要更好地了解抗原-佐剂相互作用、药物特性和各种效价测量之间的相互关系。铝佐剂作为使用历史最长的疫苗，其安全性已有大量的数据，并且相对其它新型佐剂，它的价格相对更低，基于以上考虑，它仍然是目前疫苗开发的首要选择。

参考文献

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