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4、细胞株稳定性评估

在实际过程中，实验人员通常通过表型稳定性、生产产量稳定性、产物质量稳定性、遗传稳定性，来评估细胞株的稳定性。

01、表型稳定性

指细胞株在培养过程中表型特征是否稳定，包括细胞形态、生长速度、细胞代谢等方面。这些特征应该在整个细胞培养过程中保持相对稳定，以确保细胞的生长和生产性能。理论上各个代次（PDL15、PDL30、PDL45、PDL60）细胞株在当前工艺条件下细胞生长和代谢应无显著变化，但在实际培养过程中会发现随着传代次数的增加，活细胞密度峰值也会随之提高，出现各个代次的细胞生长曲线不完全一致的情况。此时就需要根据实际情况通过评估其他3个方面的稳定性来确认是否可以接受细胞株表型的差异。

02、生产产量稳定性

各个代次（PDL15、PDL30、PDL45、PDL60）细胞株在当前工艺条件下细胞表达的产物产量应无显著变化。由于法规没有明确规定表达量变化的差异应在什么范围内，但业界一般认为通常是最高的限传代次和初始研究代次间的表达量变化在30%内即细胞株的生产产量是稳定的。

03、产物质量稳定性

各个代次（PDL15、PDL30、PDL45、PDL60）细胞株在当前工艺条件下细胞表达的产物质量无显著变化。需要对各个代次的关键质量属性进行检测，例如聚体、酸碱峰、糖型等，通过比对最高的限传代次和初始研究代次表达产物的各个质量指标的变化来判定细胞株的稳定性。

04、遗传稳定性

细胞株在传代过程中遗传物质是否稳定，包括染色体数目、结构、基因组序列等方面。细胞株的遗传物质应该在整个细胞培养过程中保持相对稳定，以避免基因突变和表型变化对细胞生长和生产性能的影响。各个代次（PDL15、PDL30、PDL45、PDL60）的基因组序列和氨基酸序列应一致，且各个代次基因拷贝数无显著变化。基因组序列和氨基酸序列一致是保证细胞株稳定的基本前提。

5、细胞株稳定性研究内容

一个理想的细胞株具备高产、单克隆、可放大、稳定、产品质量合格等基本特征。
关于细胞株稳定性的评估，目前法规并未给出明确标准定义经过具体多少PDL的传代，或者细胞表达量的具体变化率来规定某一细胞株的稳定性如何，仅要求开展细胞遗传稳定性研究，并强调遗传稳定性的规范性，如“传代稳定性研究应模拟实际生产条件(如扩增和生产阶段加压或不加压，传代周期、培养表达工艺条件等)、考察细胞水平、基因水平以及蛋白水平的稳定性，明确生产限传代次，特别需要注意的是上市申请时应评估已开展的传代稳定性研究能否满足商业化规模生产需求”。对于细胞株稳定性考察的现行业内通用做法是细胞株稳定性研究，目的是确定出细胞限传代次，确保在限传代次内其表达产物的质量和产量符合预期的要求。通常在IND申报阶段和BLA申报阶段对细胞株稳定研究的要求有所区别。

01、在IND申报阶段

采用PCB开展有限的细胞株稳定性研究，可在摇瓶或者反应器规模下开展，主要实验内容是将PCB种子细胞进行传代，同时开展带有筛选压力和不带筛选压力的两组实验进行细胞稳定性研究。通常在传代至PDL15、PDL30、PDL45、PDL60（在实际传代过程中用P5、P10、P15、P20来代替）时进行细胞冻存，并在传代过程中通过生长曲线来判断带筛选压力和不带筛选压力的影响。在整个稳定性传代结束后将各个代次冻存的细胞进行复苏，采用当前的工艺进行Fed-batch评估。该阶段重点关注各代次的细胞生长、代谢和产量的稳定性，以及产物的质量的评估。

02、在BLA申报阶段

此阶段要求更加严格，需要对MCB和WCB开展有限的细胞株稳定性研究，且需要在生产规模或者在经过验证的缩小模型中进行，其实验内容与PCB稳定性研究一致，将MCB和WCB种子细胞进行传代，通常在传代至PDL15、PDL30、PDL45、PDL60代时进行细胞冻存。在整个稳定性传代结束后将各个代次冻存的细胞进行复苏，采用商业化生产的工艺进行培养生产。该阶段重点关注各代次的细胞生产、代谢、产量、蛋白质量和遗传稳定。

案例
以下以研究人员做的表达外源 rhBMP2的CHO细胞株稳定性分析为例来介绍一组被认定为较稳定细胞株的各方面的实验数据，展示在实际的实验过程中来判断细胞株稳定性的依据，以及实际实验过程可能会出现的与理论存在的差异。

在本次实验中研究人员的侧重点主要在细胞株的遗传稳定性，通过对EOP的重组细胞进行分析来确保在长时间的培养中产物基因没有发生显著变化。同时对于此过程中获得的数据分析对获得体外细胞的传代限制至关重要。研究人员所采用的基因特征分析如Table1所示：

Table1：Genotypic Characterization Paradigm

对从rhBMP-2MCB、WCB和EOP细胞中获得的核酸进行基因型分析。采用Northern blot的方法来评估rh BMP-2的转录本的物理状态如图1所示：

图1：Northern blot analysis of total rhBMP-2 RNA isolated from MCB,WCB,and EOP cells

根据获得的结果的一致性表明细胞扩大培养和生产的稳定性。

研究人员通过使用限制性内切酶酶切核酸和酶切后的Southern blot来评估rhBMP-2表达质粒进入CHO细胞重组后细胞系基因组的完整性如图2，3所示:

图2：Southern blot analysis of HindIII-digested rhBMP-2

实验结果的一致性证明了重组细胞系基因组的完整性，以及放大生产中质粒整合的稳定性。

研究人员通过对rhBMP-2 MCB和EOP基因组的Southern blot来分析基因拷贝数的变化,如图4所示：

研究人员通过对rhBMP-2MCB和rhBMP-2EOP的DNA测序来验证基因组的稳定性，如图5所示：

图5 :Representative rhBMP-2 DNA Sequencing data

以上数据主要侧重于细胞株基因组稳定性方面，当然各代次细胞株的传代稳定性和筛选压力对细胞株的影响也是稳定性研究的重要内容。

研究人员对CHO(rhBMP-2)-C8 细胞复苏后体外连续传代 20 次, 在传代培养过程中检测细胞生长速率, 同时收集条件培养基−70°C 保存。Elisa检测其中8 代培养基上清, 在添加和不添加 MTX 两种条件下, rhBMP2 蛋白分泌速率都无明显变化, 同时传代过程中细胞比生长速率(μ)也无明显变化如图 6：

图6:在添加和不添加 MTX 条件下 rCHO(hBMP2)-C8 细胞株的稳定性

数据结果说明了 rCHO (hBMP2)-C8细胞具备传代稳定性。

细胞株稳定性研究是药物研发中非常重要的一环，它能够确保细胞株的生长和生产性能的稳定，从而保证药物的疗效和安全性。此外，细胞株稳定性研究还涉及到对细胞株的长期保存和运输的稳定性评估。在细胞株构建完成后，我们需要制定有效的长期保存和运输方案，以确保细胞株的稳定性和可重复性。随着行业技术水平的进步，对于细胞株稳定性的研究评估的标准也会更加的全面。

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