自Otto Warburg首次报道癌细胞中有氧糖酵解现象以来，已经过去100 年（Warburg，1924 年）。有氧糖酵解，也称为 Warburg 效应，是一种生长状态，具体表现为在足够的氧气情况下，葡萄糖摄取率高，糖酵解活跃，代谢产物乳酸含量高，糖酵解消耗更多葡萄糖，但产生的ATP数量比较少。与通过氧化磷酸化获得的 36 个葡萄糖（glc）产生 4 个三磷酸腺苷 （ATP） 相比，有氧糖酵解的能源效率明显较低。有氧糖酵解还会产生可能有害的乳酸量，而氧化磷酸化不会积累有毒化合物。这就引出了一个问题：当有替代机制可用时，为什么细胞选择在低效代谢状态下运行，从而产生大量的乳酸废物？

图 1.正常细胞和癌细胞之间糖酵解途径的差异。（A） 在氧气存在下，正常细胞通过糖酵解、TCA 循环和电子传输系统每个葡萄糖分子产生高达 38 个 ATP 。在缺氧环境中，丙酮酸在没有经过 TCA 循环的情况下积累。这些在肌肉组织中积累的丙酮酸转化为乳酸，只产生 2 个 ATP。（B） 癌细胞只使用糖酵解过程，无论是否存在氧气;每个葡萄糖分子产生 2 个 ATP，因此，与正常细胞相比，需要更多的葡萄糖来获取能量。

Warburg 本人通过假设有氧糖酵解是由于无法携带足够通量的线粒体缺陷而发生的，然而这一假设在许多实验中被反驳，这些实验测量了表现出有氧糖酵解的细胞中通过 TCA 循环的通量，发现线粒体功能够正常运作。然而，TCA 循环通量可能不完全来自葡萄糖，也能通过谷氨酰胺分解得到（Lee等人，2019 年;Buchsteiner等人，2018 年）。另一方面，Otto Warburg后续的工作实际表明，即使在能量方面，癌细胞产生的ATP也比正常的细胞多10-13%，这主要归应于葡萄糖摄取量高出约10倍，这使它们能够同时进行糖酵解和线粒体呼吸，而即使在没有氧气的情况下，巨大的糖酵解流产生的 ATP 也是正常细胞通过呼吸产生的 ATP 的 2/3。

尽管肿瘤抑制因子（p53）和致癌基因（SRC、AKT、RAS）似乎都与缺氧诱导转录因子 HIF 或致癌转录因子 MYC 有关，但引发癌症Warburg效应的确切分子机制仍不清楚。因此，所有糖酵解酶的亚型都是 HIF 靶基因，其启动子中带有缺氧反应元件 （HRE）。HIF通常在有氧条件下进行降解，但在缺氧条件下会稳定存在。肿瘤缺氧是一种常见现象，也是癌症患者的一个不良预后因素；然而，即使在有氧条件下，HIF 也能保持稳定，并在完全有氧条件下启动缺氧反应。在有氧状态下，脯氨酰羟化酶（PHDs）利用分子氧使HIF的α亚基羟基化，使其被 von Hippel-Lindau 肿瘤抑制因子（VHL）识别，随后在蛋白酶体中降解。葡萄糖转运体（GLUT）1 和 3 是最早被确定为 HIF 靶基因的基因之一，这与它们在增加葡萄糖摄取量（这是Warburg效应的先决条件）方面的作用一致。正如Warburg观察到的肿瘤中乳酸生成增加是糖酵解的最终反应，同时也是由 HIF 靶基因乳酸脱氢酶 A 催化的原因导致。乳酸脱氢酶 A 对Warburg效应同样重要，因为它在将丙酮酸转化为乳酸的同时，还能从前面的糖酵解反应中产生的 NADH 中再生出 NAD+，从而促进糖酵解的持续进行。

LDH 有两个结构不同的基因编码： LDH-A 和 LDH-B。由于全酶是四聚体，由两个亚基M和H组成，根据不同组织的代谢需求有不同的组成方式，因此 LDH 以五种不同的亚型存在。LDH1 由所有四个H亚基组成，即 LDH-B，而 LDH5 由所有四个M亚基组成，即 LDH-A。LDH2、LDH3 和 LDH4 由 LDH-A 和 LDH-B 的不同混合物组成。LDH-A 和 LDH-B 对乳酸和丙酮酸的相对亲和力使 LDH-A 更易促进丙酮酸转化为乳酸，而 LDH-B 更易促进乳酸转化为丙酮酸。LDH-A 的表达在所有癌症中上调，而 LDH-B 的表达在大多数癌症中下调。两种亚型相对量的这种变化促进了癌细胞中的“有氧糖酵解”，将丙酮酸转化为乳酸。

图2  LDH 亚型和四聚体。（A）LDHA 亚型，也称为肌肉（M）亚基，主要位于细胞质中，部分位于细胞核中;LDHB 亚型，也称为心脏（H）亚基，位于线粒体和胞质中;睾丸特异性 LDHC 亚型的亚细胞定位与 LDHA 亚型相似。（B）LDH 亚基的四聚化形成对底物和器官分布具有不同亲和力的 LDH 同工酶

从有氧糖酵解的另一个现象来说，癌细胞产生大量的乳酸，这不仅是 “有氧糖酵解 ”的结果，也是由于生长代谢通路的加速。除非从细胞中去除这种乳酸，否则细胞的 pH 值会变成酸性并干扰正常的生物和代谢过程，从而不利于癌细胞的存活。为了逃避这种后果，癌细胞会通过质膜输出乳酸并将其释放到细胞外培养基中。这导致肿瘤微环境中出现严重的乳酸酸中毒。将乳酸从癌细胞释放到细胞外培养基中对于支持“有氧糖酵解”至关重要，因为胞质溶胶中的酸性 pH 值会抑制糖酵解酶的活性。此外，LDH 的活性、促进细胞增殖和逃避细胞凋亡需要略碱性的细胞内 pH 值。同时，酸性细胞外 pH 值限制了正常的细胞生长和存活。癌细胞比正常细胞更能适应酸性环境，因此它们可以通过调整新陈代谢来生存。肿瘤微环境中正常细胞的死亡为肿瘤的生长扫清了空间。此外，肿瘤微环境中较低的 pH 值为癌细胞抑制免疫细胞和降解细胞外基质提供了有利的环境，从而促进了癌细胞的生存、侵袭和转移。

然而，这种有氧糖酵解现象已经对生物治疗性蛋白质生产构成了相当大的挑战，因为哺乳动物生产细胞通常分泌高水平的乳酸。乳酸积累对细胞的生长、活力、蛋白质生产和产品质量有害，直接导致培养物pH降低的同时通过添加碱来控制培养物 pH 值还容易导致渗透压增加。因此，几十年来的大量工作旨在控制Warburg 效应在生物工艺中的作用。CHO细胞的Warburg效应是其在工业化培养中适应高能量需求和快速增殖的代谢策略，但乳酸的过度积累成为工艺瓶颈。基于Warburg 效应的动力学原因与乳酸生成代谢的内在联系，科研工作者通过各种工艺优化策略，进一步调控CHO细胞在蛋白生产工艺中的表现，延长细胞培养周期，减少乳酸积累的同时延缓细胞凋亡，提高重组蛋白产量与质量。通过解析代谢调控机制并采取多维度优化策略，可实现更高效的生物制造过程。

Warburg 效应在增殖哺乳动物细胞(包括癌细胞)中普遍存在，对生物制药生产构成挑战，因为乳酸积累会抑制细胞生长和蛋白质生产。由于在哺乳动物的细胞培养中，乳酸脱氢酶已被证明是必要存在的，因此以往通过基因敲除手段，消除乳酸积累的努力都未成功。Hooman Hefzi和Iván Martínez-Monge等通过同时敲除乳酸脱氢酶和参与通常抑制丙酮酸转化为乙酰-CoA的负反馈回路的调节因子，基于CHO-S建立Warburg-null无Warburg效应表型工程化细胞，消除了中国仓鼠卵巢（CHO）和 HEK293 细胞中的Warburg 效应。与长期以来对有氧糖酵解作用的假设不同，Warburg-null 细胞在保持野生型生长速度的同时，产生的乳酸几乎可以忽略不计。Warburg-null CHO 的进一步表征细胞显示耗氧量的补偿性增加，几乎完全依赖于氧化代谢，并且在补料分批细胞培养中的表现出更高细胞密度。Warburg-null 工程化细胞能够适用于生产多种生物治疗性蛋白质，同时还能达到工业要求的蛋白滴度以及维持目的产物所需的糖基化。因此，消除Warburg效应的能力是生物治疗生产的一项重要发展，并为研究近乎普遍的新陈代谢现象提供了一种工具。

实验结果显示，去除丙酮酸周围的反馈回路能够完整的消除哺乳动物细胞中的 LDH 活性，而不会对细胞生长产生负面影响。实验通过在 CHO 和 HEK293 细胞中同源敲除乳酸脱氢酶和四种 PDKs 来实现这一目标。细胞能够维持增殖，同时消耗的葡萄糖明显减少。实验进一步表征消除 Warburg 效应的表型反应并证明这些细胞仍然适合用于生物制药行业。此外，研究还表明，将Warburg 效应缺失表型引入单克隆抗体（mAb）生产细胞系中，可保持产品滴度以及诸如糖基化等重要质量属性。这些结果表明，在生物工艺中，Warburg 效应并非获取生物量前体以促进哺乳动物细胞生长和蛋白质生产的必要条件，而消除该效应的方法为生物治疗药物的生产改进开辟了新的途径。

Le'a Monte'gut、Pablo Ce'sar Martı'nez-Basilio等通过使用癌症治疗药物，针对CHO细胞不同水平的Warburg效应进行研究，第一种药物α-硫辛酸（一种丙酮酸脱氢酶激活剂）可通过增加回补反应来补充Krebs循环，但同时会导致线粒体饱和。第二种药物亚甲蓝的电子穿梭功能增强线粒体的能力。它在减少应激信号的同时，还促进了无丝分裂途径，使 mAb 的最大产量增加了 24%。最后，这两种药物的组合被证明在刺激Krebs循环活性和线粒体呼吸方面有重要作用。因此，用于新陈代谢治疗的药物是了解和改善基于 CHO 的生物生产的新陈代谢限制的候选药物。

α-硫辛酸（α-LA）作用于糖酵解/TCA 循环而亚甲蓝（MB）用于增强呼吸通路。α-硫辛酸（α-LA）是丙酮酸脱氢酶激酶 （PDK） 的潜在抑制剂，可激活丙酮酸脱氢酶 （PDH），从而导致丙酮酸含量增加，通过 PDHK 失活促进丙酮酸进入线粒体，并与许多其他 TCA 酶相互作用，并起到抗氧化剂的作用。MB 是一种合成染料，由 Heinrich Caro 于 1876 年首次制备，被证明可以促进癌细胞 、神经元和心脏细胞的呼吸。它通过刺激线粒体膜上的氧化还原交换来增加线粒体活性，从而刺激质子周转率。

实验考察两种药物不同浓度条件进行研究，每种条件准备3个重复实验。在 10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、200 μM 和 500 μM 时评估 α-LA 的效果;而 MB 的评估浓度为 10 nM、100 nM、500 nM、1 μM 和 10 μM。

实验评估出α-LA 和 MB 具有明显的显着代谢作用。药物通过单独测试和联合测试，并且与3个对照进行比较：未处理（对照），仅用于 α-LA 给药的载体（0.1% 乙醇，对照 + 载体）处理，并用已知的 PDH 激活剂处理（DCA 5 mM）。除了 100 μM α-LA 细胞生长受到影响，在所有培养物中观察到相似的细胞生长和活力行为。 证实了 MB 对活力的积极影响，1 μM MB 的水平为 84 ± 1%，与 20 μM Α-LA 联合使用时为 82 ± 3%，而对照为 73± 4%。

图5 给药后的代谢反应

实验结果表明，通过上调 PDH，α-硫辛酸（α-LA）药物被证明可有效将厌氧通量重新定向到线粒体，从而增加 TCA 活性。然而，高于 100 μM 的 α-LA 会干扰 ETC 处严格调节的氧化还原状态，诱导重要的应激信号，而 20 μM 保持最小的应激水平。有趣的是，使用 1 μM 的亚甲蓝（MB）能够表现出最好的结果，在最小应激水平下线粒体活性增加，mAb 产量增加。尽管 MB 和 α-LA 的组合导致 mAb 产生的增加不如单独使用 MB 明显，但它能够改善细胞呼吸，在维持低ROS水平（MB）的同时，还能促进丙酮酸进入线粒体（α-LA）和拉动供给TCA循环的回补途径的协同作用，揭示了CHO细胞和癌症细胞之间代谢相似性的调节。

图6 氧化磷酸化、厌氧糖酵解和有氧糖酵解（Warburg 效应）之间差异的示意图。在氧气存在下，非增殖（分化）组织首先通过糖酵解将葡萄糖代谢为丙酮酸，然后在氧化磷酸化过程中将线粒体中的大部分丙酮酸完全氧化为 CO2。因为需要氧气作为完全氧化葡萄糖的最终电子受体，所以氧气对于这个过程是必不可少的。当氧气有限时，细胞可以通过产生乳酸（厌氧糖酵解）将糖酵解产生的丙酮酸从线粒体氧化磷酸化中重定向。厌氧糖酵解过程中乳酸的产生允许糖酵解继续进行（通过将 NADH 循环回 NAD），但与氧化磷酸化相比，导致 ATP 产生最少。Warburg 观察到，无论是否存在氧气（有氧糖酵解），癌细胞都倾向于将大多数葡萄糖转化为乳酸。正常增殖组织具有这种特性。线粒体仍然正常运转，一些氧化磷酸化反应在癌细胞和正常增殖细胞中继续存在。

研究通过另一种思路，是通过加速TCA对丙酮酸的利用，来降低乳酸的生成，提升葡萄糖利用效率。丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）在这一过程中扮演重要角色，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A从而进入TCA循环。PDC的活性通过丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）来负调控，磷酸化后的PDC将失去活性。实验选取PDK的化学抑制剂，即二氯乙酸（DCA）来提高PDC的效能，尝试让更多葡萄糖/丙酮酸进入TCA循环，减少乳酸生成。

实验设计使用CHO-XL99，CHO-K1的衍生细胞株，表达完整的IgG1抗体。通过简单培养（Batch），流加培养（Fed batch），流加补糖培养（Fed batch plus glucose）三种类型的培养方式，将每种类型分别设计，加入5mM二氯乙酸的DCA组和不含DCA的对照组。

表1

实验结果表明：所有培养中添加DCA均可提高VCD峰值、延长培养周期和提高产量。

1. 在指数生长期间，DCA将葡萄糖消耗和乳酸产生分别降低了约35±3%和40±3%，导致单位乳酸的产生和葡萄糖消耗降低了7%。

表2

2. DCA 对聚集水平、酸性和碱性变体或糖型没有重大影响（表 3）。单体的百分比略低，而二聚体和多聚体的百分比较高。同样，在 DCA 培养物中观察到从碱性变体到酸性变体的轻微变化。

表3

3. DCA在不影响Qp和产品质量的情况下，改善了培养表现：缓解Warburg效应，提高了峰值活细胞密度、培养持续时间和最终抗体滴度。在补料分批流加葡萄糖的培养中观察到的效果最显著，培养时间延长了3天，最终的抗体滴度水平增加了一倍。

乳酸代谢是工业哺乳动物细胞培养的最重要特征之一，并且由于其对细胞培养性能和生产力的不利影响，减少乳酸产生是细胞系和工艺开发过程中的集中要解决的问题。有氧糖酵解的减少对细胞培养性能和最终抗体滴度有正效应，并且细胞比生产力和抗体质量不受影响。因此，减少乳酸积累一直是细胞培养开发中的一项持续挑战，以提高生长、生产率和工艺稳健性。

参考文献：

【1】 Nicholas Luke Cowie. A kinetic description of the Warburg effect in CHO cells.

【2】 Kim, S.-H.; Baek, K.-H.Regulation of Cancer Metabolism by Deubiquitinating Enzymes: The Warburg Effect. Int. J. Mol. Sci. 2021,22, 6173. https://doi.org/10.3390/ijms22126173.

【3】 Xu K , Yin N , Peng M , Stamatiades EG. Glycolysis Fuels Phosphoinositide 3-Kinase Signaling to Bolster T Cell Immunity. 13 Mar 2020.https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989707

【4】 Mathew, M.; Nguyen, N.T.; Bhutia, Y.D.; Sivaprakasam, S.; Ganapathy, V. Metabolic Signature of Warburg Effect in Cancer: An Effective and Obligatory Interplay between Nutrient Transporters and Catabolic/Anabolic Pathways to Promote Tumor Growth. Cancers 2024, 16, 504. https://doi.org/10.3390/ cancers16030504.

【5】 Hooman Hefzi, Iván Martínez-Monge. Multiplex genome editing eliminates the Warburg Effect without impacting growth rate in mammalian cells. https://doi.org/10.1101/2024.08.02.606284.

【6】 Monte ´gut L, Martı´nez-Basilio PC, da Veiga Moreira J, Schwartz L, Jolicoeur M (2020) Combining lipoic acid to methylene blue reduces the Warburg effect in CHO cells: From TCA cycle activation to enhancing monoclonal antibody production. PLoS ONE 15(4): e0231770. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0231770.

【7】 Matthew G. Vander Heiden et al. Understanding the Warburg Effect: The Metabolic Requirements of Cell Proliferation. DOI: 10.1126/science.1160809.

【8】 Buchsteiner M , Quek LE , Gray P , Nielsen LK. Improving culture performance and antibody production in CHO cell culture processes by reducing the Warburg effect. 22 May 2018, 115(9):2315-2327.https://doi.org/10.1002/bit.26724.

【9】 Kocianova E.; Piatrikova V.; Golias, T. Revisiting the Warburg Effect with Focus on Lactate. Cancers 2022, 14, 6028. https://doi.org/10.3390/cancers14246028.