现代生物制药行业的快速发展需要治疗性重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能。哺乳动物细胞能够生产类似于人蛋白的翻译后修饰和糖基化类型，所以大规模哺乳动物细胞无血清悬浮培养技术已经应用到越来越多的领域。

无血清悬浮培养的优势

传统的贴壁生长培养中需要添加血清，而其所含成分复杂，不同产地和批次之间存在质量差异，影响工艺的稳健性。又因血清中有多种杂蛋白不利于蛋白分离纯化，还有潜在的外源病毒感染风险。无血清悬浮培养也成为动物细胞培养技术的发展方向。主要由于其具有培养基的化学成分限定、细胞生理环境可控、批次产品质量稳定、易于大规模培养等优势，广泛应用于重组蛋白、单克隆抗体和疫苗生产。

悬浮驯化的方法

1. 物理方法

贴壁细胞驯化至无血清悬浮培养，通常采用物理方法。一般分为梯度驯化和直接驯化。梯度驯化分为两种方式：1）先转换至悬浮培养，后梯度降低血清比例，至无血清悬浮培养；2）在贴壁培养条件下，梯度降低血清比例，至无血清培养后转至悬浮培养。直接驯化即直接从贴壁状态转换至无血清悬浮培养，这种方式驯化周期较长，难度较大，不过也有成功驯化案例。

Martin S.Sinacore等使用三步法实现了哺乳动物细胞从贴壁状态驯化至无血清悬浮培养，即贴壁细胞先进行悬浮驯化，再进行无血清梯度驯化后在生物反应器中进行高密度驯化，使贴壁细胞在驯化过程中逐步适应无血清悬浮生长环境。驯化过程中需要添加适合细胞生长的培养基及关注细胞的生长状态和形态，确保每个阶段细胞生长倍增正常且冻存备份后进行下阶段。Suyang Wu等优化了培养基添加组份以加快无血清悬浮驯化的过程。发现贴壁CHO细胞从100%完全生长培养基驯化至75%完全生长培养基过程中，添加Ca2+和Mg2+ 能显著降低细胞倍增时间。另外，通过合理的筛选设计发现在10%完全生长培养基驯化至无血清生长培养基过程中，Ca2+和DMEM培养基的相互作用能显著影响活细胞密度和细胞活率。

2. 基因工程方法

通过分子生物学方法，编辑贴壁细胞基因，使其能快速适应悬浮培养环境。Namil Lee等使用高通量RNA测序并结合设计RNA引导的Cas9核酸酶编辑技术，筛选并发现敲除Igfbp4和Aqp1基因能有效加快CHO细胞的悬浮适应过程。Chia Chu等将贴壁依懒性MDCK细胞转染了人siat7e基因，将其驯化为贴壁非依懒性细胞，能够在悬浮状态生长。

悬浮驯化后细胞的变化

在贴壁细胞成功驯化至悬浮状态后，往往看到的都是细胞表型方面的变化，比如细胞的形态，生长速度等。其实在基因水平，细胞可能已经发生了明显的改变。以工业界使用最广的CHO细胞为例，使用不同的无血清悬浮驯化方法得到的悬浮细胞，构建表达同一个外源蛋白，得到的稳转细胞株，其生长、表达量和质量会有不小的差异。Costa等研究了表达某单抗的CHO-K1细胞从含10%血清条件降低血清比例（含不同的添加物），不同比例的血清和添加物对蛋白N-糖基化修饰水平、产品质量和生物学活性都会产生影响。

Shridhar等研究发现CHO细胞悬浮驯化前后的转录组变化，发现有几个与细胞外基质相关的基因表达水平发生了明显改变。同时还发现与类异戊二烯和几种脂类的生物合成相关通路出现显著的表达上调，与细胞膜转运相关的通路则出现了一定程度的表达下调有密切联系，说明在含血清的环境下，细胞更多依赖血清所提供的脂类，如果脱离血清，细胞需自身合成所需物质。

无血清悬浮培养技术的应用

应用于病毒类疫苗生产领域：Shen等将贴壁的Vero细胞驯化成无血清悬浮细胞，优化生产表达水疱性口炎病毒（VSV）培养工艺后，最高活细胞密度能达到8x106cells/mL。悬浮细胞感染病毒的产量明显高于贴壁细胞，且通过优化接毒细胞的密度，产量最高能提高3.8倍。驯化的悬浮细胞维持基因水平的稳定，也没有发现致瘤性。

应用于重组药用蛋白表达：Silva等使用无血清悬浮培养的Sk-Hep-1、HKB-11和Huh-7人细胞系表达人促红细胞生成素（EPO），特别是用Huh-7细胞表达EPO的产量高于业内水平。

上海领康时代目前有CHO和人源293细胞系，不同CHO宿主细胞系有CHO-K1、CHO-K1-GSKO、CHO-S、CHO-DG44。同时已建立成熟的人源293悬浮细胞重组蛋白表达平台系统。

随着日益成熟的哺乳动物无血清悬浮培养技术，越来越多的生物制品使用悬浮技术工艺制备临床生产样品。但针对不同细胞系的驯化方法仍需要重视对产品质量的影响，另外完整、合规的细胞驯化实验记录和溯源资料对于产品的临床申报也是至关重要。

参考文献
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2. Adaptation of Mammalian Cells to Growth in Serum-Free Media.
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4. Targeted gene deletion using DNA-free RNA-guided Cas9 nuclease accelerates adaptation of CHO cells to suspension culture.
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6. 哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术研究进展，中国畜牧兽医 2021,48(3)：839-845
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