背 景

CHO 细胞系是生产重组生物制品的常用哺乳动物细胞系，因其适应悬浮、无动物源或化学成分限定基培养，增殖迅速，易于基因操作，且糖基化模式与人相似等特点，而获得广泛的认可和应用。

在稳定细胞系构建过程中，常用的筛选系统包括二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）筛选系统。DHFR 系统存在细胞系构建时间长、去除筛选压力后不稳定的问题；GS 系统虽有时间优势，但在 CHO 细胞中使用甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX）筛选时，仍会有大量低产克隆存活，会影响筛选效果，且 MSX 对提高蛋白表达量的作用有限，去除 MSX 后表达量可能会下降。而CHO-GS 基因敲除技术的出现，可以降低低表达克隆比例，提高细胞株稳定性，加快了细胞株开发的进程。

CHO-GS 基因敲除技术原理：谷氨酰胺合成酶能催化谷氨酸和氨生成谷氨酰胺，生成的谷氨酰胺在生物体内的蛋白质合成、氮代谢和解毒等过程中起着重要作用。所以当把GS 基因敲除后，细胞自身无法合成谷氨酰胺，必须依赖外源提供或导入具有功能的 GS 基因才能在无谷氨酰胺的培养基中生存，而未成功导入或表达的细胞则因缺乏谷氨酰胺而死亡，以此实现对目标细胞的筛选。

如何实现CHO-GS 基因敲除技术呢？以下就以TALENs、ZFNs和CRISPR/Cas三大基因编辑技术详细展开介绍。

ZFNs技术作用机制

锌指核酸酶（ZFNs）由锌指结构域和 FokI 切割域构成，其中锌指结构域能特异性识别并结合目标 DNA 序列，多个锌指串联可增强靶向性，FokI 切割域需二聚化才有切割活性。当两个 ZFN 分别结合到相邻目标序列时，FokI 切割域二聚化，在特定位置切割 DNA 产生双链断裂（DSB）。细胞面对 DSB 会启动修复机制，有同源供体 DNA 时，通过同源重组以其为模板修复，实现靶向基因替换；没有同源供体 DNA 时，主要通过非同源末端连接修复，常导致断裂位点突变，即靶向诱变。下图（图1）为ZFNs技术的作用机制示意图。

图1. ZFNs技术的作用机制示意图

优势

具有强大的靶向能力，能特异性识别并切割目标 DNA 序列，引发细胞的 DNA 修复过程，实现靶向诱变和基因替换，且在多种生物（涵盖动物、植物及哺乳动物细胞）的基因编辑中均取得成功应用，为基因功能研究和生物遗传改良提供了有效手段。同时，从理论上讲可应用于任何生物的基因编辑，在实验生物、作物改良以及人类基因治疗等多个领域都展现出了极具潜力的应用前景。

劣势

主要体现在设计和选择的复杂性上，大量 ZFN 对的设计或筛选会失败，即便专业机构也需要反复测试和优化；锌指结合特异性有限，容易结合到脱靶位点，导致脱靶效应，当脱靶切割严重时会使细胞或生物体死亡； DNA 修复机制在不同生物、细胞类型和发育阶段存在差异，这使得 ZFN 引发的基因编辑结果难以预测和控制，进而限制了其应用范围。

TALENs 技术作用机制

转录激活样效应因子（TAL）是一类新发现的特异性 DNA 结合蛋白，由植物致病细菌 Xanthomonas 产生，其靶向特异性由中央串联重复结构域决定，重复可变双残基（RVD）与靶核苷酸一一对应。TAL 效应因子可与 FokI 核酸酶融合成 TALENs，成对结合并切割 DNA，用于基因组编辑。下图（图2）为TAL 效应因子和TALEN的结构以及它们的作用机制示意图。

图2. TAL效应因子和TALEN的结构以及它们的作用机制示意图

优势

TALEN 能凭借 TAL 效应因子的 RVD 精确识别并结合特定 DNA 序列，靶向特异性强，可精准作用于目标基因位点；应用范围广泛，不局限于物种和细胞类型，在植物、动物、微生物等领域均可施展拳脚；且不受 PAM 序列限制，选择编辑位点时更灵活，为基因编辑提供了更广阔的操作空间。

劣势

TALEN 设计构建过程繁琐，需依据目标序列精心设计并组装 TAL 效应因子的重复结构域，对技术和操作要求高；存在脱靶风险，虽特异性较强，但仍可能对非目标位点进行编辑，影响编辑结果的准确性与安全性；其分子相对较大，在载体递送时面临挑战，会影响导入细胞的效率，限制了实际应用。

CRISPR/Cas9 系统作用机制

CRISPR/Cas9 系统源于细菌的适应性免疫系统，经改造用于基因编辑。sgRNA 的间隔序列识别目标 DNA，引导 Cas9 蛋白结合，Cas9 蛋白的 REC 叶和 NUC 叶协同作用，通过识别 PAM 序列定位目标。结合后，RuvC 和 HNH 结构域分别切割非目标链和目标链，造成双链断裂。之后细胞利用非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制修复断裂处，NHEJ 产生随机插入或缺失突变，HDR 借助供体模板实现精准编辑。下图（图3）为CRISPR/Cas9 系统的作用机制示意图。

图3. CRISPR/Cas9 系统的作用机制示意图

优势

设计合成 sgRNA 即可靶向编辑，相比传统工具更简便经济；可用于基因治疗、构建模型、全基因组筛选等多个领域；能高效快速地实现精准基因编辑，在多种细胞和生物体内发挥作用。

劣势

存在脱靶效应，影响结果准确性和治疗安全性；递送系统各有缺陷，病毒载体有随机整合和免疫风险，非病毒载体递送效率低；Cas9 蛋白可能引发免疫反应，基因编辑还可能激活 p53 通路，导致细胞死亡或增加致癌风险。

以下通过相关文献的研究表明在GS基因筛选系统中 CHO-GS基因敲除细胞系优于传统CHO细胞系。

实验一：在本研究中，设计了靶向 CHO GS 基因以破坏基因组位点的特异性 ZFN，并将其用于生成 GS 敲除 CHOK1SV 细胞系。为了评价 GS 敲除选择效率的提高，试验了专有的人源化 IgG4 mAb-B分子在细胞系生成（CLG）工艺中表达，下图（图4）体现了该工艺测试了三种不同条件的数据：蓝色为历史培养工艺（K1 亲本细胞，50 μM MSX 的压力进行细胞池筛选和高接种密度），绿色为当前培养工艺（K1 亲本细胞，50 μM MSX 的压力进行细胞池筛选和低接种密度）以及红色为当前使用 GS-KO细胞作为宿主的培养工艺（25 μM MSX 的压力进行细胞池筛选）。在三种批量培养条件中，GS-KO细胞表现出最严格的选择，电转染后第 17 天活细胞密度（VCD） 最低且活率恢复较慢（图 4A 和4B）。由于这种更严格的选择，在当前标准条件下，使用25 μM MSX筛选的GS-KO细胞池的表达量几乎是 CHOK1SV 细胞池表达量的2倍，比历史条件细胞池的表达量高出约4倍（图 4C）。

图4. IgG4 mAb-B分子在细胞系生成工艺中表达数据图

实验二：使用荧光激活细胞分选仪对筛选出来的细胞池进行单细胞克隆。将筛选出来的单个克隆在96孔板中扩增后，从每组中合并适当数量的单个克隆。使用自动细胞培养评估系统 （ACES） 评估每个克隆的初始相对滴度结果。下图（图5）显示了进一步研究去除内源性 GS 基因后的表达分布，通过ACES 分析单个单细胞克隆在第 14 天的产量的相关数据。与 CHOK1SV 细胞相比，GS-KO细胞在 MSX 选择后显示出非生产细胞和低生产细胞的大幅减少，这种不需要的单个细胞的减少可能是平均生产率显著提高的直接原因。从绿色柱状图能明显的看出GS-KO细胞在较高滴度区间柱子高度高，而CHOK1SV 细胞在较低滴度区间柱子高度高，这意味着GS-KO 细胞克隆的单克隆抗体滴度多集中在高水平；多数 CHOK1SV 细胞克隆的单克隆抗体滴度集中在低水平。

图5. ACES评估单克隆抗体的初始相对滴度结果图

结 论

     利用基因编辑技术敲除细胞的 GS 基因显著提升了细胞株开发的效率和质量。它增强了筛选的严格性，大幅减少非生产和低产细胞，富集高产细胞，提高了筛选的效率，缩短了筛选的周期 。而且，通过基因编辑技术敲除细胞的 GS 基因对重组蛋白质量无明显负面影响，保障了产品品质，为生物制药产业提供了更高效、更具经济价值的细胞株开发路径。

参考文献

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