在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达体系中，异源蛋白的稳定性常受宿主内源蛋白酶系统（包括胞质蛋白酶体、液泡蛋白酶及分泌途径相关酶系）的协同攻击。此类蛋白水解事件不仅直接造成目标产物产量损失，更会引发发酵液组分复杂性增加，由此显著提升下游层析纯化的分离难度。对于治疗性蛋白等生物制品而言，此类问题直接影响产品的质量属性（如活性、免疫原性），对生物制品的质量均一性与规模化生产提出严峻挑战。本文将浅谈毕赤酵母蛋白酶系统同时列举部分在发酵工艺开发过程中抑制蛋白酶降解的常用方法。
一、毕赤酵母蛋白水解系统的核心组成
毕赤酵母的蛋白水解系统由三大类蛋白酶构成：细胞质蛋白酶体、液泡蛋白酶和分泌途径相关蛋白酶。
这些蛋白酶通过协同或独立作用，调控细胞内蛋白质的降解、加工与稳态维持。以下将详细解析每类蛋白酶的结构、功能及其对异源蛋白稳定性的影响。
二、细胞质蛋白酶体（Proteasome）
结构与功能
细胞质蛋白酶体是毕赤酵母中负责泛素-蛋白酶体途径的核心降解机器，主要功能是清除错误折叠蛋白、短寿命调控蛋白及应激损伤蛋白。
◆ 20S核心颗粒：由14个不同亚基（分子量22-25 kDa）组成，形成4层环状结构（α7β7β7α7），具有胰蛋白酶样、胰凝乳蛋白酶样和半胱氨酸蛋白酶样活性位点。
◆ 26S全酶复合体：由20S核心颗粒与两个19S调节颗粒组成（总分子量约1700 kDa），依赖ATP识别泛素化标记的底物，并展开底物以进入核心降解腔。
作用机制与调控
◆ 泛素化标记：靶蛋白通过泛素连接酶系统（E1-E2-E3）被标记，形成多泛素链，随后被19S颗粒识别。
◆ 应激响应：在营养缺乏、氧化应激或高温条件下，蛋白酶体活性上调以清除损伤蛋白。
◆ 对异源蛋白的影响：重组蛋白若未正确折叠或携带易降解序列（如暴露的疏水区域），可能被泛素化并快速降解。
抑制策略
◆ 调控培养条件：降低细胞应激（如控制溶氧、优化碳源）可间接减少蛋白酶体活性。
◆ 分子伴侣共表达：通过共表达Hsp70或Hsp90家族蛋白，辅助异源蛋白正确折叠，避免被识别为错误蛋白。
三、液泡蛋白酶（Vacuolar Proteases）
液泡是毕赤酵母的主要降解区室，其蛋白酶系统在营养胁迫时高度活跃。液泡蛋白酶分为内肽酶、外肽酶和膜结合酶三类，具体种类如下。
内肽酶
◇ 蛋白水解酶A（PrA，Pep4p）
◆ 基因与结构：由PEP4基因编码，为天冬氨酸蛋白酶，前体含405个氨基酸，经信号肽切除、糖基化及自催化激活形成活性酶。
◆ 功能：激活其他液泡蛋白酶（如PrB、CPY），是液泡蛋白酶级联反应的“主开关”。敲除PEP4可显著降低液泡蛋白酶活性。
◆ 对异源蛋白的威胁：PrA缺陷菌株（如SMD1168）可减少重组蛋白的液泡依赖性降解，但可能影响细胞生长。
◇ 蛋白水解酶B（PrB，Prb1p）
◆ 基因与结构：由PRB1基因编码，属枯草杆菌蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶。前体（69 kDa）经PrA剪切去除前肽后形成活性酶（31-33 kDa）。
◆ 功能：参与液泡内蛋白降解及前体加工（如α-因子成熟）。
◆ 调控：PrB活性依赖PrA，双敲除菌株（pep4 prb1）可完全消除其活性。
外肽酶
◇ 羧肽酶Y（CPY，Prc1p）
◆ 功能：特异性水解C端芳香族或疏水氨基酸残基，依赖丝氨酸活性位点。
◆ 成熟过程：前体（69 kDa）经液泡内PrA剪切为活性形式（61 kDa），糖基化对其折叠至关重要。
◆ 应用案例：CPY糖基化位点突变导致分泌延迟，提示糖链保护作用。
◇ 羧肽酶S（CpS，Cps1p）
◆ 特点：金属离子依赖性羧肽酶，前体（576 aa）经液泡内剪切释放活性酶（73-77 kDa）。
◆ 底物偏好：降解C端小分子残基（如甘氨酸、丙氨酸）。
◇ 氨肽酶I（ApI，Lap4p）与氨肽酶Co（ApCo）
◆ ApI：金属外切酶，含12个亚基（640 kDa），无需信号肽直接靶向液泡。
◆ ApCo：需Co²⁺激活，分子量约100 kDa，功能与ApI互补。
膜结合酶
◇ 二肽氨肽酶B（DPAP-B，Dap2p）
◆ 定位与功能：液泡膜锚定酶，水解二肽N端残基，参与液泡膜蛋白周转。
◆ 结构：含841个氨基酸，N端胞质域、跨膜锚定域及C端催化域。
液泡蛋白酶的激活与调控
◆ 自噬与内吞作用：液泡通过自噬小体（autophagosomes）和内吞途径摄取胞质蛋白，PrA和PrB在此过程中激活。
◆ 营养胁迫响应：碳源或氮源饥饿时，液泡蛋白酶活性显著上调，加剧异源蛋白降解。
四、分泌途径中的蛋白酶
分泌途径中的蛋白酶主要负责前体蛋白的加工与成熟，但其活性也可能误伤分泌过程中的异源蛋白。
◇ 信号肽酶（Sec11p）
◆ 功能：切除分泌蛋白N端的信号肽，确保正确转运至内质网（ER）。
◆ 结构：多亚基膜整合复合体，18 kDa亚基由SEC11基因编码。
◇ Kex2蛋白酶（Kex2p）
◆ 功能：切割前体蛋白中的双碱性位点（如Lys-Arg），参与α-因子和杀伤毒素前体加工。
◆ 结构：枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，依赖Ca²⁺活性，定位高尔基体。
◆ 对异源蛋白的影响：若重组蛋白含类似切割位点（如抗体轻链连接区），可能被误切。
◇ Kex1羧肽酶（Kex1p）
◆ 功能：特异性去除C端碱性残基（如Lys、Arg），与Kex2协同完成前体加工。
◆ 工业应用：在抗体生产中，需避免重组蛋白C端暴露Kex1识别序列。
◇ 酵母天冬氨酸蛋白酶III（Yap3p/Yps1）
◆ 功能：在Kex2缺失时，可替代切割双碱性位点，但效率较低。
◆ 结构：与Kex2类似，含跨膜锚定域，活性依赖天冬氨酸残基。
五、蛋白水解系统的调控策略
◇ 液泡蛋白酶的特异性抑制
◆ 基因工程菌株：
· pep4 prb1双敲除菌株（如SMD1163）几乎完全消除液泡蛋白酶活性，适用于稳定性差的蛋白（如胰岛素样生长因子）。
· 案例：抗冻蛋白在SMD1168菌株中产量提升至12.8%（野生型仅4%）。
◆ 局限性：缺陷菌株生长缓慢，需优化培养基（如补充氨基酸）以维持生产率。
◇ 分泌途径蛋白酶的规避设计
◆ 序列改造：避免在重组蛋白中引入Kex2/Kex1识别位点（如将Lys-Arg替换为抗性序列）。
◆ 融合标签：添加保护性标签（如His-Tag）覆盖易切割区域。
◇ 蛋白酶体的间接调控
◆ 抑制应激信号：通过控制溶氧（DO）、降低甲醇流加速率，减少错误蛋白积累。
◆ 分子伴侣共表达：共表达BiP（内质网伴侣）或Hsp104（胞质伴侣），提升异源蛋白折叠效率。
◇ 培养条件的精细化控制
◆ pH调节：低pH（3.0-4.0）抑制胞外丝氨酸蛋白酶（如PrB），但需平衡细胞活力。
◆ 温度策略：诱导期降温（如30°C→20°C）减少蛋白酶活性。
◆ 竞争性底物添加：添加酪蛋白水解物，竞争性抑制蛋白酶活性；精氨酸（0.4 M）可抑制胰蛋白酶样活性。
Xianzong Shi等人发现，研究发现，在BMMY诱导培养基中添加0.4 M/L-精氨酸、5 mM EDTA或2%酪蛋白氨基酸，可使单链抗体（scFv）产量提升约3-5倍，其中酪蛋白氨基酸的添加效果最为显著（图1）。
通过以0.5% L-天冬酰胺替代酵母提取物的实验发现，虽然细胞生长未受影响，但scFv产量显著下降。与此相反，添加0.4 M/L-精氨酸虽抑制了细胞生长（与Chung和Park的报道一致），却显著促进了scFv的积累。
图1. 不同添加物对单链抗体（scFv）降解的影响。
图A 展示了在30°C条件下，BMMY基础培养基（空白对照）及补充精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、酪蛋白氨基酸（CA）或EDTA的BMMY培养基中，甲醇诱导24小时后的活细胞数量变化。虚线表示接种物中的初始活细胞数量。
图B 通过抗His-HRP抗体的Western blot分析，呈现上述培养液中单链抗体（scFv）的累积情况。左侧边栏标注了蛋白质分子量标准品（单位：kDa）。
表1. 不同蛋白酶抑制剂在Ovine Interferon-T发酵中72H发酵液上清对蛋白酶活性的影响
注：由于蛋白酶抑制剂一般价格高昂，一般大规模生产中较少使用该方法来抑制目的蛋白的降解。
七、结论
毕赤酵母的蛋白水解系统是一把“双刃剑”：其内源性蛋白酶在维持细胞稳态中不可或缺，却严重威胁异源蛋白的稳定性。通过深入解析蛋白酶的分类、激活机制及调控网络，并结合基因工程、培养优化与蛋白设计的多维策略，可显著提升重组蛋白的产量与质量。未来，随着蛋白酶组学与合成生物学技术的进步，毕赤酵母有望成为更高效、更可控的蛋白表达平台。
参考文献
1、The proteolytic systems and heterologous proteins degradation in the methylotrophic yeast Pichia pastoris . Ann Microbiol. 2007; 57: 553-560.
2、Production of protein-based polymers in Pichia pastoris. Biotechnol Adv. 2019; 37(5): 642-666.
3、Production of Therapeutic Single-Chain Variable Fragments (ScFv) in Pichia pastoris. Methods Mol Biol. 2022:2313:151-167.
4、Causes of proteolytic degradation of secreted recombinant proteins produced in methylotrophic yeast Pichia pastoris: case study with recombinant ovine interferon-tau. Biotechnol Bioeng. 2005; 89(1): 102-12.
