毕赤酵母（Komagataella phaffii），曾被称为Pichia pastoris，是一种广泛应用于重组蛋白合成的表达系统，尤其在人类治疗性蛋白和食品工业中表现突出。其优势在于能够实现高密度培养，显著提高蛋白产量；同时，宿主细胞蛋白（HCP）负担低，简化了下游纯化流程。此外，通过基因工程改造，已开发出能够实现人源化糖基化的菌株，进一步提升了其在治疗性蛋白生产中的应用价值。这些特性使Komagataella phaffii成为工业蛋白表达领域的理想选择。
图1. 毕赤酵母K. phaffii的研究领域
毕赤酵母的研究历史可以追溯到20世纪初
(1) 1904年，德国微生物学家E. Hanssen首次建立“毕赤酵母属”（Pichia），奠定分类学基础。
(2) 1919年，法国科学家Alexandre Guilliermond首次从法国栗树的分泌物中分离出一种酵母菌株，并将其命名为Zygosaccharomyces pastori（现保存为CBS704，NRRL Y-1603），这一菌株被认为是毕赤酵母的最早记录。
(3) 随后，在20世纪50年代，美国微生物学家Herman Phaff从加利福尼亚州的黑橡树中分离出更多的菌株，并将其重新命名为Pichia pastoris。
(4) 到20世纪70年代，Phillips石油公司（位于美国俄克拉荷马州巴特尔斯维尔）开发了一种利用毕赤酵母发酵生产高蛋白动物饲料和单细胞蛋白的工艺。该公司通过亚硝基胍诱变技术开发了NRRL Y-11430菌株（现保存为CBS7435），并利用其高效的甲醇代谢能力进行大规模发酵生产。
(5) 然而，随着全球石油危机的爆发，甲醇价格大幅上涨，使得单细胞蛋白生产的经济性下降。Phillips石油公司于1993年决定将毕赤酵母表达系统开放给研究实验室使用。此后，学术界和生物技术公司开始将注意力转向利用毕赤酵母作为重组蛋白生产的宿主。
(6) 20世纪90年代，研究人员开发了多种表达载体和遗传修饰技术，使得毕赤酵母成为重组蛋白生产的理想宿主。例如，Invitrogen公司（现为ThermoFisher Scientific）推出了著名的“Pichia Expression Kit”，其中包含两种表达菌株（GS115和KM71）和两种表达载体（pPIC9和pHIL-S1），用于将目标基因稳定插入AOX1基因位点。
GS115菌株是通过亚硝基胍诱变NRRL Y-11430菌株获得的组氨酸营养缺陷型突变体（his4Δ），而X-33菌株则是在GS115基础上通过HIS4基因回补改造而成，恢复了组氨酸自主合成能力。这些菌株的开发极大地简化了发酵工艺，并提高了重组蛋白的产量。
图2. 毕赤酵母菌株发展时间轴
(7) 1995年，随着分子生物学技术的发展，科学家们通过对核糖体RNA的测序分析，发现Pichia pastoris与其他酵母属的差异较大，因此将其重新归类为一个新属——Komagataella。（工业领域仍习惯统称“毕赤酵母”Pichia pastoris）。
(8) 2005年，C. Kurtzman进一步将毕赤酵母分为两个物种：Komagataella pastoris（包含法国分离株，简称K. pastoris）和Komagataella phaffii（包含美国分离株，简称K. phaffii）。这两个物种在基因组上有约10%的差异，并且存在两个相互易位。
表1. 主要染色体的基因组组装和注释统计
图3. K.pastoris（橙色）和K. Phaffii（绿色）在使用不同碳源发酵过程中表达的基因总数差异。圆的大小与给定条件的基因总数成正比
Love, K.R.等人研究结果表明，在甲醇培养条件下，基因的翻译活性显著高于基于葡萄糖或甘油的培养条件。这一发现暗示，在甲醇培养中可能发生了更广泛的转录激活。
进一步分析发现，不同物种在甲醇培养中，选择性和高度表达的基因数量增加了两到三倍，这表明甲醇培养条件下，基因表达的多样性显著提高。
(9) 毕赤酵母的基因组研究为其在基础研究和工业应用中的进一步发展提供了重要支持。2009年，科学家们完成了GS115菌株的全基因组测序，随后在2011年和2016年分别完成了CBS7435和DSMZ 70382菌株的基因组测序。这些基因组数据为毕赤酵母的基因功能注释和代谢网络重建提供了坚实的基础。
毕赤酵母的基因组大小为9.4 Mbp，包含四条相对较大的染色体（2.9 Mbp、2.4 Mbp、2.3 Mbp和1.8 Mbp）。与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相比，毕赤酵母的基因组结构更为简单，但其染色体大小几乎是酿酒酵母最大染色体的两倍。此外，毕赤酵母的着丝粒结构与高等生物更为相似，具有较大的模块化着丝粒，这为研究真核生物的染色质重塑和着丝粒功能提供了有价值的模型。
图4. 毕赤酵母研究里程碑
参考文献
1、Komagataella phaffii as EmergingModel Organism in Fundamental Research. Front Microbiol. 2021: 11: 607028.
2、OPENPichia: licence-free Komagataella phaffii chassis strains and toolkit for protein expression. Nat Microbiol. 2024; 9(3): 864-876.
3、Comparative genomics and transcriptomics of Pichia pastoris. BMC Genomics. 2016: 17: 550.
