中国生物制品学杂志2024年11月第37卷第11期

摘要

目前，药品质量管理模式已从“检验控制质量”和“生产控制质量”模式发展为“设计控制质量”模式，强调风险评估、过程控制及持续监测和改进在生产过程中的应用。质量源于设计（Quality by Design，QbD）的理念在治疗性单克隆抗体领域应用较多，但在其他生物制品，特别是疫苗类产品中应用较少，这与疫苗结构复杂、工艺较为传统及质控方法变异度较大等因素有关。加快 QbD理念和框架在我国疫苗行业的实施，对提升我国疫苗特别是新型疫苗的质量、安全性和有效性具有重要意义。本文对 QbD在疫苗研发中的应用进展作一综述，并分析存在的问题和挑战，以期推动QbD理念在疫苗行业的应用，为进一步提升我国疫苗研发和质控水平提供参考。

关键词：质量源于设计；分析方法质量源于设计；过程分析技术；疫苗

2002 年，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）提出了“21 世纪现行药品生产管理规范（Current Good Manufacture Practices，cGMP）”，引入了质量源于设计（Quality by Design，QbD）的概念，作为新药开发和质控的基本工具，并提出应用过程分析技术（Process Analytical Technologie，PAT）推进 QbD 理念的实施。PAT 是对生产过程中关键质量参数（Critical Quality Attributes，CQAs）、原材料和中间产品及生产全过程进行周期性检测控制，以确保终产品质量达到标准的一套系统，是 QbD 框架实施的主要手段之一，可促进和加强 QbD理念在医药领域的实施。2005 年，国际人用药品注册技术协调会（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）发布指南 Q8（药物研发），随后发布指南Q9（质量风险管理）。Q8纳入QbD概念，即药品质量不是通过检验来控制，而是在对工艺及药品自身特性理解的基础上设计而来的；Q9 介绍了质量风险控制原则和应用实例。2008年，ICH发布了指南Q10（药品质量体系），系统地介绍了产品生命周期质量目标设定和达成。分析方法质量源于设计（Analytical Quality by Design，AQbD）是 QbD 在分析方法中的应用，相对药品工艺开发，AQbD尚处于初期阶段。

目前，QbD 框架多用于小分子药物和单克隆抗体的研发、监管和生产。美国 Roche／Genentech公司应用 QbD原理研发了 2种治疗性重组单克隆抗体药物，即奥妥珠单抗（Gazyva）和阿替利珠单抗（Tencentiq），均已在美国获批，据报道，Gazyva是首个全面基于 QbD 原理获批的生物制品。随后，该公司发表了系列文章，描述 QbD 原理在治疗性单克隆抗体药物研发中的应用。但由于疫苗结构和质控复杂，生产过程以传统工艺为主，且QbD框架在疫苗行业的应用报道较少，已上市疫苗尚未按完整的QbD框架文件申报。本文对QbD在疫苗研发中的应用进展作一综述，并分析存在的问题和挑战，以期推动 QbD 理念在疫苗行业的应用，为进一步提升我国疫苗研发和质控水平提供参考。

1、QbD、AQbD和PAT的简介

1.1 QbD   QbD理念是指药品质量不依赖于产品的最终检测，而需通过评估和细化生产工艺，确定物料属性及工艺参数与CQA的关系，创建工艺设计空间，结合质量风险管理建立更优的控制策略，为药品生产和质量控制提供保证，使产品生产过程在批准的设计空间内进行工艺变更，无需额外进行监管提交和批准，从而实现灵活的工艺控制。1992年，JURAN首先提出QbD的概念，认为产品的特性和失败率较大程度上取决于质量计划。2004年，FDA在21世纪cGMP倡议中提出，将QbD概念作为开发新药相关工艺的基本工具，并推动使用 PAT 来促进 QbD 框架的实施。2005年，ICH Q8（R2）指南将QbD定义为“一种以预先设定目标为起始，基于可靠的科学和质量风险管理，强调对产品和生产过程的理解，对工艺控制的系统研发方法”。ICH Q8（药物研发）、ICH Q9（质量风险管理）、Q10（药品质量体系）、Q11（原料药风险管理和生命周期）和 Q12（生命周期管理）贯穿于小试研发、工艺开发、生产和质量管理，共同构成基于QbD的药品生命周期风险管理体系。

1.2 AQbD   AQbD 是将 QbD 的概念应用于分析方法的开发过程，在药品生产系统的各环节质量监控中发挥关键作用。AQbD 理念经历了由概念提出至相关指南文件逐渐完善的过程。2015年，FDA提出，应按 QbD 理念进行分析方法开发，2021年，《美国药典》1220章节引入分析方法生命周期的概念，并于2022年实施，基于AQbD和风险评估管等理念，将分析方法的分析目标概要（Analytical Target Profile，ATP）、分析方法设计、验证和应用监控作为 1 个动态循环的生命周期，从而确保分析方法在整个生命周期中能始终符合预期目的。同年，FDA 发布了 ICH Q2（R2）和 Q14 征求意见稿，Q14 提出将 ATP 的概念整合至方法开发中，用基本的及增强的科学方法进行分析方法开发；Q2（R2）就如何应用和评估各种验证方法提供了指导和建议，描述了分析方法验证研究及如何将先验知识纳入验证研究设计中。Q2（R2）与Q14文件相互补充，构成了对分析方法如何实行AQbD的技术指导。

1.3 PAT   根据2002年FDA在21世纪cGMP倡议中的定义，PAT是“一套通过实时监测原料和生产过程的关键质量属性来设计、分析和控制生产，确保最终产品质量的系统”，其作用是通过在线检测和控制来减少废品率，进而达到实时放行和缩短生产周期的目的。2004年，FDA发布了PAT指南，潜在愿景是运用创新、基础科学工程知识和质量管理高效制药。随后，FDA、欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）、ICH 均开始发布相关指南（如 ICH Q8⁃Q11），以提高生产过程中的产品质量，从而促进连续生物加工。2021年，《欧洲药典》提出，利用生物化学和生物物理分析技术在线实时监测生产过程。有报道表明，在疫苗生产过程中，采用PAT监测抗原吸附有助于新产品开发及其生命周期管理，进一步了解工艺，并通过实时连续监测和决策减少批次损失。2022年，有报道表明，在大规模活病毒疫苗生产中使用PAT工具实时监测细胞密度等关键工艺参数，起到了强化疫苗过程控制的作用。

2、QbD理念在疫苗中的应用

QbD 理念可应用于新型疫苗的整体开发设计，也可应用于疫苗特定工艺参数优化和 CQA 的确定。AQbD 应用于分析方法有助于建立稳健灵敏的分析方法，了解方法的性能，准确稳定地检测疫苗 CQA。实施 PAT 可实时监测关键工艺参数（Critical Process Parameter，CPP），有助于实施疫苗实时放行。

2.1 疫苗开发中QbD框架的应用

2.1.1 细菌性疫苗   多糖蛋白结合疫苗生产工艺步骤复杂，包括细菌培养、多糖纯化、蛋白发酵、表达和纯化、多糖和蛋白结合及制剂配伍等多个工艺阶段，影响生产控制和质量的因素较多，因此多糖蛋白结合疫苗应用QbD案例对其他种类疫苗开发具有较强的指导作用。

由GSK、Medimmune、MSD、Pfizer、Sanofi Pasteur等5家企业专家组成的药学研究⁃疫苗工作组（Chemical Manufacturing and Control ⁃ Vaccines Working Group，CMC⁃VWG）报告了 QbD 应用于疫苗的案例模拟研究，研究共包括 10 个部分，1～3 部分介绍了 QbD和疫苗的背景及如何实施的概念，包括目标产品特性（Target Product Profile，TPP）、CQA、CPP 及其控制策略；4～8部分分别对多糖上游工艺、多糖下游工艺、类病毒颗粒（virus⁃like particle，VLP）和疫苗成品等描述如何应用 QbD理念进行风险评估、筛选及确定CQA和CPP，实验设计(Design of Experiment, DOE)、实施失败模型分析及基于对工艺理解的持续改进和监测等；第 8 和 9 部分分别为监管部门和实施的考虑；鉴于传统减毒活疫苗的工艺特点与多糖结合疫苗明显不同，第 10部分报告了流感病毒减毒活疫苗如何应用QbD的案例。该研究展示了QbD在复杂的多糖结合蛋白疫苗模型上下游和成品工艺过程中部分工艺的具体应用思路和方法，提出除提供更稳健高效的制造工艺外，QbD还具有加快疫苗开发速度，更快将产品推向市场的优势，并增加了对工艺的理解，从而可与监管机构进行更透明的合作。

国家药品监督管理局药品审评中心报道了基于多糖蛋白结合疫苗的结构特点分析多糖结合疫苗需关注的 CQA，讨论如何在早期工艺研发过程中筛选最适的CPP及在临床验证中建立适宜的质量标准。文章基于QbD理念，结合审评经验，分析了对结合疫苗 3 个成分 CQA 的认识，重点讨论各生产阶段在CPP 确定及工艺验证中需考虑的变量，提出对制剂处方包括剂型、剂量的考虑，并认为在质量标准应建立在全面的结构确证基础上，进行多批次样品临床试验将有助于建立CQA质量标准限度范围及工艺稳定性评价。

2.1.2 mRNA疫苗   与单克隆抗体生产类似，mRNA疫苗技术路线具有易平台化生产和质量控制的特点。mRNA 疫苗的生产工艺一般包括 mRNA 体外转录合成、切向流过滤和 RNA 纯化及脂质纳米颗粒包封等步骤。由于生产平台与疾病的靶标无关，可应用相同的生产工艺生产不同的 RNA 序列, 生产过程仅需改变模板 DNA，其他材料、设备、操作工艺等可保持一致。

2021 年，有研究应用 QbD 框架对 mRNA 疫苗开展研究，阐述在 mRNA 合成过程中 CPP 对 CQA 的影响特征及 CPP 的设计空间，该研究整合了新的定性方法和定量生物过程模型，应用定性方法确定并评估核苷酸三磷酸、Mg2+浓度、T7酶浓度和反应时间等4 种 CPP 对 mRNA 完整性、序列鉴别和产量的 3 个CQA 影响方向、程度和特性，并绘制了 4 种 CPP 对mRNA 产量影响的量化模型，给出了 mRNA 疫苗合成反应的设计空间。有文献显示，应将对CQA、产品⁃工艺交互影响、相关工艺分析技术和过程建模功能的评估纳入QbD 框架，用于制造工艺的未来开发、设计和控制，将有助于mRNA技术充分发挥其潜力，QbD框架将成为快速响应、与疾病靶标无关的mRNA平台生产工艺的开发、资格预审和监管批准的核心。因此，mRNA 疫苗的生产工艺设计需全面了解 CQA 和 CPP 之间的关系，开发多种 PAT 工具实时监测CQA，以确保疫苗成品质量，促进mRNA疫苗快速研发、生产和审批。

2.1.3 病毒灭活疫苗   2014 年，有报道展示了 QbD框架在候选疫苗中实施过程，应用风险评估鉴别可使用科学和历史知识组合定义的CPP及需通过实验进行额外工艺表征的 CPP，采用 DOE 系列评估 CPP参数与 CQA 的相互作用，应用 QbD框架可简化候选疫苗的工艺开发，有利于建立符合法规要求的可靠而稳定的制造工艺。

2019年，我国江南大学研究者分析了 Vero细胞生产人用疫苗收获发酵液中影响 CQA（细胞密度和抗原滴度）的CPP，结果表明，H2O2和补料培养基（CB4）显著影响抗原滴度，而乙醇胺可显著改善细胞最终浓度，进一步通过 Monte Carlo 模拟，确定 H2O2、乙醇胺和 CB4 等 3 个 CPP 的设计空间分别为每 48h 10-2～10-1mmol／L、1.9~7.3mg／mL和0.35%~1.3%（v／v）。该研究还探讨了用幼仓鼠肾脏⁃21 细胞生产兽用疫苗CPP对CQA的影响，结果发现，细胞培养持续时间是影响 TCID50和抗原滴度的最显著因素，而感染期培养温度和pH的影响较小；感染期培养温度是影响总蛋白的唯一重要因素，进一步通过 Monte Carlo 模拟，确定了细胞培养时间、感染温度、感染pH和收获时间等 CPP 的设计空间分别为 53～57h、35.9～36.7℃、7.3～7.7 和 11～14h，并在 4000L 生产规模验证了该策略的有效性。疫苗的传统工艺研究过程较为繁琐和复杂，采用 QbD 框架对生产工艺进行优化提升，可解决在生产工艺放大和技术转移中出现的关键参数变化较大和工艺不稳定的问题，极大缩短了疫苗研发周期。

2.1.4 其他疫苗及工艺   QbD 框架也已应用于寄生虫疫苗、DNA 疫苗及通用冻干工艺的优化和设计空间的研究中。有研究报道，采用 DOE 研究疟疾疫苗D1M1的纯化CPP，获得了优化常用的多模式离子交换工艺。在部分工艺中应用 QbD 框架，是提升疫苗质量的关键，特别是纯化工艺和制剂工艺的优化，对疫苗的纯度、杂质残留和疫苗稳定性至关重要。

2.2  AQbD在疫苗分析方法上的应用

明确疫苗检测方法的性能和变异度，是质控和评价疫苗的基础，在疫苗开发中，除物料性能属性（Critical Material Attributes，CMAs）、CPP和CQA 外，检测方法的准确度和变异对疫苗的工艺的开发也发挥关键作用，AQbD的基本路线为设置ATP、方法影响因素的风险分析，确定方法的关键影响因素，通过 DOE 研究影响因素的交互影响，确定方法设计区间，经验证获得符合ATP目标的检测方法，进一步持续检测进行生命周期管理。

2013年，美国 MSD公司报道了应用 QbD理念成功开发出HPV疫苗检测试剂及放行四价蛋白疫苗的4种体外相对效力免疫测定法，采用统计设计实验优化方法参数及设计空间，建立了满足预设目标的免疫测定方法，这是 QbD 框架首次在疫苗效价质控方法开发中的应用。近期，该公司又发表文章阐明了 AQbD 在方法建立的优势及在变更中的作用。另外，有报道阐述了高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）在 mRNA、细菌类疫苗开发中的应用情况。

中国食品药品检定研究院建立的 SARS⁃CoV⁃2重组蛋白抗原检测方法和 SARS⁃CoV⁃2 中和抗体检测方法，是首个依据《美国药典》1220 生命周期、ICHQ2（R2）及Q14 AQbD理念开发的疫苗质控方法。通过 ATP 设定、风险分析、DOE 和方法验证，获得了符合 ATP 的疫苗检测方法，首次明确了方法的性能指标，如容忍区间、预测区间、总变异等，为开发和评价相关疫苗提供了工具。

2.3  PAT在疫苗开发中的应用

PAT 是一个鼓励创新的指导方针监管框架，应用 PAT 的目的旨在了解生产工艺，通过在线检测和控制来缩短生产时间，防止产生废品，提高连续生产的效率。

2.3.1 细菌性疫苗   2007 年，STREEFLAND 等对PAT 在百日咳菌培养中的适用性进行了研究，通过使用 DNA 微阵列评价干扰因素对细胞生理和产品质量的影响，确定产品质量的标记基因，为定量评估产品质量提供了手段。随后，有研究将 PAT 的一般原则和工艺设计空间应用于全细胞疫苗，对培养批次进行在线监测和控制，以确保在过程设计空间内实时运行。

2021年，加拿大 Sanofi Pasteur 公司以破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）为模型蛋白，研究抗原对磷酸铝和氢氧化铝佐剂的小规模吸附过程。通过在线ReactIRTM、ParticleTrackTM和EasyViewerTM探针进行实时监测，在小型反应器中监测磷酸铝和氢氧化铝对TT 的吸附过程，并使用在线红外探头 ReactIR 监测TT 的构象变化，进一步通过粒径，计数和成像工具测量蛋白吸附相关的颗粒，结果显示，ReactIR 能够有效地监测氢氧化铝和磷酸铝对TT的吸附过程，可用于分析抗原吸附的机理。

2.3.2 减毒活疫苗    美国 MSD 公司研究显示，在大规模活病毒疫苗（live virus vaccine，LVV）生产开发中，PAT工具可及时监测 CPP，并有效指导工艺开发和表征。在商业规模生产中，这些工具可实时监测CPP，并为收获决策提供信息，预测效价峰值，并作为效价签发的替代指标。PAT工具主要用于LVV制造的上游和下游工艺监测，包括电容探头在生物反应器中实时监测活细胞密度，利用高效成像确定微载体工艺中的最佳感染时间，使用流式病毒测量仪监测上游和下游工艺步骤中的病毒颗粒总数，使用核酸染料染色来区分“完整”和“受损”病毒颗粒，并通过该策略监测下游加工工艺中可能产生的病毒聚集体，PAT 工具的使用可显著增强对 LVV 生产过程的控制。

除应用于上述生产过程外，PAT 还可应用于生产过程的其他阶段，如过滤、无菌灌装、小瓶缺陷检查或颗粒物检查，冷冻干燥等过程。有研究建立了一种带有联机测量回路的实验性错流过滤装置，目的是实现VLP蛋白生产中的PAT，测量回路包括监测VLP蛋白浓度和结构的紫外和可见（ultraviolet and visible，UV／Vis）光谱仪及光散射光度计（dynamic light scattering，DLS）。应用实验装置对在不同跨膜压力下分别进行了3次组装的3种不同结构重组乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）VLP 进行监测。其中 DLS 提供了有关蛋白组装进度的信息，UV/Vis 可基于酪氨酸 132 微环境监测蛋白浓度和VLP组装率，通过离线DLS和透射电子显微镜（trans⁃mission electron microscope, TEM）验证 VLP 的形成，进一步应用偏最小二乘（partial⁃least square, PLS）模型进行校准以预测工艺溶液中的 VLP 蛋白浓度，结果表明 ，3 种 重 组 HBcAg VLP 的 Q2值 为 0.947 ~0.984，该实验装置为开发和监测VLP重组蛋白工艺提供了平台。

3、小结与展望

疫苗开发包括传统方法和基于 QbD 的强化方法。传统方法需先确定工艺参数的操作范围及设定值，再通过证明工艺的可重复性及检测疫苗是否符合已确立的标准来控制疫苗质量；而 QbD 强化开发方法则更多应用风险管理和科学知识，识别影响CQA 的 CPP 操作空间，并持续监测进行生命周期管理。QbD 强化方法有利于企业对工艺的了解和完善，更有利于监管部门了解企业工艺及变更。目前，QbD框架在我国应用于疫苗开发既具有紧迫性也面临风险和挑战。

3.1 疫苗行业实施QbD框架的紧迫性

第四次工业革命（工业4.0）集成了物联网、人工智能（Artificial Intelligence, AI）、机器人和高级算法等技术。工业4.0 框架的重点是质量 4.0，要求对产品和工艺有深入了解，这将导致制药质量模式发生重大转变，从合规性驱动和检测方法的应用转向基于风险和QbD方法。我国“十四五”医药发展规划中提出支持建设新型病毒载体疫苗、DNA 疫苗、mRNA 疫苗、疫苗新佐剂和新型递送系统等技术平台，推动了相关产品的开发和产业化。其中mRNA疫苗研发已成为我国疫苗行业研发的热点，在序列优化等工艺中也开始应用AI和高级算法，如百度生物计算用AI首次提升了mRNA序列的稳定性、有效性，智能化技术平台将成为未来疫苗发展的趋势，因此，需加速推动疫苗行业实施QbD以适应制药业发展趋势和十四五医药发展规划的要求。

3.2 应用实施 QbD 框架的风险和挑战

目前，我国疫苗的主要品种仍以传统经典工艺模式研发和生产，如减毒活疫苗、灭活疫苗等。基于传统和经验工艺生产的疫苗安全有效，研发数据为监管部门认可，且《中国药典》疫苗各论中对各品种均规定了较详细的 CPP 和 CQA，相关指导原则也有较明确详细的要求，为后续研发企业确定 CPP 和 CQA 提供了便利，疫苗企业有较多的法规参考，较难主动转变疫苗研发理念推动QbD框架的实施。QbD框架的实施需专业人员和资源，但现阶段，疫苗企业和监管机构缺乏相应的统计和熟练使用模型的人员，QbD 的实施不仅需要改变现有疫苗的管理模式，还需要大量资源的投入，如PAT的实施需在仪器设备、数据分析处理系统及质量管理等方面进行更新或完善。另外，国内外监管部门尚未制定出可行的 QbD 框架实施细则，疫苗企业也无完善的可参照的实施流程，疫苗研发中QbD框架的实施仍处于早期阶段。传统疫苗抗原成分复杂，某些疫苗保护机制及确切靶点不确定，缺乏有效的功能试验判定疫苗安全性与产品属性之间的关系等性质，导致 CQA 与 CPP 之间的关系认识不全面，致使设计空间的建立面临较大挑战。

3.3 展望

药品监管部门一直在推动加强对药品的工艺理解和过程控制。QbD、AQbD和PAT等可应用于多个类型的疫苗工艺，将疫苗工艺趋向于平台技术，有效推动疫苗工艺的发展。因此，应建议尽快出台相关的指南或操作细则，加速在我国推行QbD理念，强化疫苗QbD而非仅依靠检验的理念，将疫苗质控由检验模式转为设计和在线监测模式，推动疫苗发展趋向平台技术，整体提升我国疫苗工艺能力和质量水平。