Designing a Strategy for pH Control to lmprove CHO Cell Productivity in Bioreactor

一、生物反应器操作

在本研究中，使用了30 L和250 L搅拌罐式反应器 （STR）（Biozeen，印度），在30 L 生物反应器中使用了三个标准扇形叶轮和一个frit sparger式微泡分布器，在250 L中使用了两个frit sparger式微泡分布器。生物反应器的搅拌速度用于两个规模之间保持相同的单位体积功率输入（P/V：0.05） 水平，30 L生物反应器搅拌速度为145RPM以及250 L生物反应器搅拌速度为100RPM。在30 L和250 L生物反应器中，O2 flow分别保持在0.1 LPM（升/分钟）和3 LPM。根据实验设计overlay flow通气流速在 5-15 LPM之间。在两个生物反应器中，罐体高度与罐体直径（H/D）的比率为1.5:1，而叶轮与罐体直径（Di/Dt）的比率为 0.34。

二、生物反应器补料分批培养

生物反应器接种的初始工作体积分别是26L和178L，接种密度为0.65×106cells/ml，培养时，Day2开始每天补充相应的培养基（2%的feed A和0.2%的feed B）。当葡萄糖浓度低于1g/L时，使用400g/L的葡萄糖溶液进行补充。使用纯氧底部通气，将溶解氧DO控制在60%。pH设定点7.0，可调节死区0.1。通过碳酸氢钠缓冲液（0.5M）来控制pH在实验设计的设定点。

三、实验设计

1、Plackett-Burman 实验设计

采用 Plackett-Burman 设计研究了5个操作参数的潜在影响，包括目标单抗生产的葡萄糖浓度设定点、溶解氧浓度设定点、表层通气流速（overlay）、碳酸氢钠缓冲液添加量（控制pH）和搅拌速度，选择缓冲液添加量作为分类变量。使用 Minitab 18（Minitab Inc.，美国）设计了 18组试验（中心点3个），以筛选两个水平上的变量（表 1）。根据初步实验获得的数据选择操作参数值（DO浓度、葡萄糖浓度、表层通气流速和搅拌速度范围在 40-60%、1-3 g/l、5-15 LPM 和 115-145 RPM 之间调整）。所有实验均在实验设计确定的条件下在 30 L STR 生物反应器中进行（重复）。对响应变量进行回归分析，以找出影响培养产物的最重要因素。

2、使用中心复合设计对所选变量进行统计优化

对2个选定的因素进行 RSM 以评估它们的准确关系并确定其最佳水平。采用中心复合设计在 30 L STR 生物反应器中测试 13 种不同的工艺条件。表 2 展示了所选因子的取值范围。将中心点重复 3 次以评估实验误差 。分析响应数据以生成二次（二阶）多项式模型。通过计算响应变量的实验值和预测值之间的相关系数，进一步衡量模型的拟合度。

表2 Thirteen trials of the CCD matrix for (A) overlay air flow rate(LPM) and (B) agitation speed (RPM) with the response (Y)(mAbtiter) (mg/) and average pH of 15 days of culture (X)

3、模型验证

使用所选因子的最佳值平行进行三次培养实验，以验证统计模型。然后在大型生物反应器（在 250 L STR 生物反应器中独立运行三次）中进行验证实验，并通过Tukey多重比较测试进行分析。单位体积的恒定叶轮功率（P/V=0.05）用作放大标准。其余工艺参数保持不变，与 30 L生物反应器的设定值相似。

四、结果与讨论

使用Plackett-Burman筛选重要参数：考虑到酸性条件下 pH 值的突然下降会剧烈影响大规模生产期间的产量，优化细胞生产率需要控制影响培养 pH 值的不同参数。因此，乳酸和 CO2积累被认为是影响培养 pH 值的主要参数。根据实验设计，在不同的葡萄糖浓度和溶解氧设定点以及不同的气体流速（overlay）和搅拌速度下运行 18 组补料分批培养，以研究工艺参数对细胞培养pH值和细胞生产率的影响。此外，还研究了通过在所需 pH 设定点添加缓冲液来控制pH值，以揭示其对最终mAb表达水平的特定影响。之前有报道称，空气/N2鼓泡可用作控制大型生物反应器 pH 值的工具。然而，这种鼓泡策略会导致泡沫形成并增加污染率。此外，鼓泡诱导的泡沫可能会改变细胞代谢和气体去除率。因此，Plackett-Burman 筛选设计中不涉及空气鼓泡。

根据 Plackett-Burman结果，表层通气流速和搅拌速度被确定为显著影响mAb生产的主要因素（分别为p=0.024和p=0.001）（p≤0.05 的变量被认为是显著因素）（表 1）。工艺参数的主要效应以图 1 中的Pareto图形方式显示。显著参数的正系数（t 值）表示，随着值的增加，响应变量（蛋白滴度）也会增加（图 1），但系数为负表示如果变量增加，则响应变量减小。因此，增加搅拌速度和表层通气流速（两个重要参数）导致响应变量水平升高（mAb 表达水平）。其余参数（缓冲液添加量、葡萄糖浓度和 DO浓度）被确定为不显著（表 1）。


先前报道，在低氧水平（低水平DO设定）下，乳酸形成增加导致培养 pH 值和生产率下降。如表 3 所示，检测范围内的DO设定既不影响 pH 值，也不会影响 mAb 表达水平。这一发现与Restelli等人获得的结果一致，他们在正常氧浓度条件下没有发现生长速率和最终促红细胞生成素滴度的显著差异。

葡萄糖浓度也可导致乳酸积累。已经表明，当葡萄糖被限制时，乳酸的形成会减慢。因此，乳酸浓度会影响细胞比生产力。在本研究中，当葡萄糖设定点在 1-3 g/l 之间变化时，qLac 的水平为 1.7-3.3 pg/（cell×h）（表 3）。然而，观察到范围内的乳酸积累与最终结果滴度之间没有相关性 （p>0.05）。这一发现与先前发表的一项研究的结果一致，该研究报告称，乳酸积累不能显著改变抗体生产的 pH 值。

尽管添加碱或酸以及CO2鼓泡通常是生物反应器中 pH 控制的一般解决方案，但 Plackett-Burman分析表明，通过添加缓冲液来控制 pH 波动对响应变量（mAb 滴度）没有显著影响（表 3）。与未处理的对照培养相比，在控制 pH 值的条件下添加缓冲液会导致渗透压大幅上升（实验编号7和9），同时细胞活力也会显著降低51±3%。

即使添加缓冲液后培养的 pH 值保持在所需范围内，但mAb的最终表达水平并没有改善（表 1）。总的来说，通过添加缓冲液来控制pH值并不能有效提高培养生产力，会导致渗透压浓度升高，或者活率下降。因此，Zhou等人报道了高渗透压对抗体融合蛋白生产的不利影响。此外，据报道，当混合不均一时，添加碱性物质进行pH控制会导致局部pH值大幅波动。

表 3 显示了每个Plackett-Burman实验的最大活细胞浓度 （MVCC）、细胞活率、滴度值、qLac、pCO2和 pH值曲线。结果显示，生产率较高的实验组与较高的平均 pH 值和较低的 pCO2水平相关。尽管如此，不同条件之间的 MVCC 没有统计学上的显着差异 [应用单因素方差分析（ANOVA）来确定统计显着性 （p=0.05）]。根据结果，发现pCO2是影响培养 pH 值的主要因素，其主要受搅拌速度和表层通气流速影响。

综上所述，可以推测控制 pCO2不仅对控制培养 pH 值有利，而且也是重要手段。尽管pCO2水平升高的负面影响已经有了明确的研究，但大多数生产过程尚未采用有效且切实可行的控制策略。考虑到CO2的积累受两个主要参数（搅拌速度和表层通气流速）的影响，我们通过 CCD 测试了这些参数的影响，以找到每个参数的最佳水平。