1、细胞株稳定性研究在药物研发中的重要性

在CMC开发的起点——细胞株的构建中，细胞株稳定性研究在细胞株的评估中有着非常重要的作用。细胞株稳定性包括三个方面：生长表达稳定性、遗传稳定性和储存稳定性。细胞株构建阶段的稳定性研究主要在生长表达稳定性和遗传稳定性两方面，旨在细胞株构建阶段通过模拟后期大规模生产代次、工艺或条件对候选单克隆细胞株进行评估，以探究并保证细胞株的可放大性及表达蛋白质量的过程。

NMPA、FDA、EMA、ICH等相关指南文件均对细胞株稳定性提出明确的要求，通过解读现有法规指南文件，对细胞株的要求重点强调两个方面：一个是生产的细胞株必须是单细胞来源，另一个就是生产的细胞株需能满足稳定而连续生产。这两点始终贯穿于细胞株开发的整个过程。

2、影响细胞株稳定性的因素

影响细胞株稳定性的因素非常广泛，例如细胞的类型、表达载体的构建、生产工艺技术和细胞储存等因素都有可能会对细胞株的稳定性产生影响。

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞来源于中国仓鼠(Cricetulus griseus)，是生物制药工业生产重组蛋白药物的首选表达系统。超过70%批准上市的重组蛋白药物是在CHO细胞中进行表达生产的，与其他表达系统相比CHO细胞具有以下明显优势：

(1)  目的蛋白易于表达并被分泌至胞外；

(2)  具有准确的翻译后修饰功能，表达的外源重组蛋白与天然蛋白生物学特性及理化性质相似；

(3)  可在无蛋白、无动物源培养基中进行高密度的悬浮培养，利于工业化生产；

(4)  自身分泌的内源性蛋白较少，利于重组蛋白的分离和纯化。

CHO细胞最显著的特征是其适应性，使得细胞能够在各种培养条件下生长增殖并高效表达重组蛋白。利用CHO细胞生产重组药物蛋白时保持细胞的稳定高效表达至关重要，但目前在长期传代培养过程中仍存在重组蛋白表达失稳、甚至表达显著下降的问题，且其发生的分子机制尚未阐明。

下面以CHO细胞为例来介绍一些常见的对细胞株稳定性产生影响的因素。

研究认为，由于基因拷贝数丢失、基因沉默等因素对基因表达调控的影响，是造成CHO细胞表达的不稳定性(异质性)进而导致重组蛋白产量下降的重要原因。然而在哺乳动物细胞中，多个转基因拷贝的串联重复序列比单拷贝转基因更容易发生DNA甲基化和基因沉默的这一现象表明了表观遗传调控很可能对重组蛋白表达具有重要影响。

2.1、表观遗传调控对重组CHO细胞株稳定性的影响

表观遗传学(epigenetics)是研究在各种因素的影响下，DNA序列不发生变化时，基因的表达出现可遗传变化的一门学科。表观遗传主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA (miRNA)等相互作用的机制来实现。就表观遗传调控方面的作用而言，重组CHO细胞的生产可变性可归因于表观遗传介导的目的基因表达载体启动子的不稳定性，例如DNA甲基化就是启动子不稳定的一个促成因素。另一方面，组蛋白修饰而非DNA甲基化与重组CHO细胞的生产不稳定性也有关联。此外，miRNA作为一种内源性非编码小RNA，几乎调节所有与重组蛋白表达相关的重要细胞生理过程(如增殖、代谢、细胞死亡、转录和蛋白质翻译修饰)，因此miRNA也与细胞株的稳定性有着密切的关联。

（1）DNA甲基化对CHO细胞稳定性的影响：

DNA甲基化(DNA methylation) DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNMT）的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团，并且DNA甲基化通常会抑制基因表达或引发基因沉默。CpG岛是基因中C（胞嘧啶）和G(尿嘧啶)大量存在的二核苷酸重复序列，可以对基因表达产生显著的调节作用：例如当基因启动子中CpG岛密度越高，其DNA甲基化程度越高对其转录水平的抑制就越强。DNA 甲基化可以通过多种方式调控基因表达：(1)发生甲基化的DNA与转录因子结合发生障碍，从而抑制转录过程从而干扰基因表达。(2)甲基CpG结合蛋白对基因表达的抑制或沉默。甲基CpG结合蛋白是特异性转录抑制物，并以蛋白复合体的形式发挥作用。(3)DNA甲基化引起染色质结构改变从而抑制基因表达。另外，DNA甲基化会阻止转录因子的进入从而诱导染色质失活，抑制染色质活化。

在CHO细胞增殖和传代过程中，表观遗传中的DNA甲基化导致驱动目的基因转录的早期启动子和增强子转录沉默是CHO细胞产生一系列不稳定因素的重要原因。CMV启动子的从头甲基化会导致CHO细胞中转基因表达减少，这些沉默事件通常伴随着CG二核苷酸的启动子甲基化和组蛋白抑制修饰的积累。CpG被DNMT甲基化的过程通过破坏转录因子的结合直接抑制转录激活从而沉默基因,甲基化的CpG位点还可以相互作用并招募抑制基因表达的蛋白质。例如CHO DG44衍生的细胞系在传代过程中失去生产力，就是由于DNA甲基化导致了转录沉默的发生。

（2）组蛋白修饰对CHO细胞稳定性的影响

组蛋白是一类小分子碱性蛋白质，主要分为5种：H1、H2A、H2B、H3、H4。组蛋白N端的翻译后修饰(posttranslational modification, PTM)包括甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化，这些修饰会影响染色质的构型、转录过程和其他以染色质为基础的生理过程。

组蛋白修饰主要通过2种机制发挥作用：第一种是直接影响染色质整体结构的修饰，第二种涉及修饰调节效应器分子的结合。同时，组蛋白修饰同样与其他DNA过程的调控有关，如DNA修复、复制和重组。为了使基因表达与发育或生理功能需要保持一致，表观遗传调节因子通过短期内的组蛋白修饰发挥核心作用，这些修饰导致染色质构象发生变化，从而改变染色质的可及性控制基因转录，激活或抑制转录。此外，转录和转录后基因调控与其他因子相互作用的非编码RNA迅速增加，充当染色质修饰物的信号、诱饵、引导和支架。这些复杂的转录动态共同导致了确定的基因表达模式、蛋白质组和代谢物图谱，这些图谱决定了表型和细胞存活。

（3）miRNA对CHO细胞稳定性影响

miRNA可以从增殖、凋亡、转录后水平、翻译水平和细胞代谢等方面影响CHO细胞重组蛋白的表达。单个miRNA在不增加细胞翻译负担的前提下，可结合多个靶基因从而调节不同的代谢途径，并且当调节不同的有益于抗体产生的代谢通路时，可能会产生叠加效应；而当代谢途径利弊参半时，则会削弱对于重组蛋白生产的积极影响。目前已有多项研究表明，miRNA可对细胞通路进行转录后调控进而改善CHO细胞生产稳定性。如Hernández Bort等通过研究CHOK1细胞系的miRNA图谱，发现超过100个miRNA在不同生长阶段存在差异性表达。此外Klanert等报道了12种miRNA能积极调节多种CHO细胞系的生长。还有研究检测到CHO基因组中许多未知的miRNA对重组蛋白生产有积极影响，如miR-18b-3p、miR-521-1-3p、miR-3667-5p和miR-3939-3p，其中miRNA-574-3p的稳定过表达表明，重组蛋白产量可平均增加30%−40%。

2.2、位点效应对细胞株稳定性的影响

目前使用较多的细胞株构建方法是通过目的基因随机整合到宿主细胞的染色体DNA上，然后通过大量的筛选获得符合要求的重组细胞株。但是，由于目的基因随机整合位点的可变性和不确定性，导致重组细胞株在长期培养过程中可能会出现目的基因拷贝数丢失和基因重排等现象，从而影响细胞后期的表达稳定性。这里就提出了位点效应这一概念，位点效应概念的提出是基于对突变果蝇的研究，指外源基因在染色体上的表达水平受到其空间结构的影响。相对的在CHO细胞基因组中的位点效应指的是外源目的基因的整合位点直接与细胞系特性如外源目的基因的表达水平和重组细胞的稳定性相关。相关研究指出：位点效应对于外源目的基因的表达可以产生增强和减弱的效应。不同的基因整合位点具有不同的结构和调控背景，基因表达活跃区域一般处于染色体开放区域。因此目的基因受不同的整合位点影响，会使得重组细胞株在长期培养中的表达水平和稳定性不尽相同。

2.3、基因扩增系统的影响

CHO细胞中两种最常用的基因扩增系统为二氢叶酸还原酶(DHFR)系统和谷氨酰胺合成酶(GS)系统。Dhfr能够被叶酸类似物氨甲喋呤( MTX) 所抑制，用含有目的基因和与dhfr基因相连的重组质粒转染DHFR-KO细胞，利用浓度不断提高的MTX筛选压力，使得dhfr基因及与之相连的目的基因一起扩增，实现目的基因高水平表达。GS在ATP水解提供能量时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，在细胞外缺乏谷氨酰胺的培养条件下，加入gs的抑制物蛋氨酸亚砜酰亚胺(methionine sulfoximine, MSX)，可使gs基因及与之相连的目的基因扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。但是，这些基因扩增系统应用时会出现染色体易位和同源重组的情况，很容易导致重组细胞产生不稳定的核型，在长期的培养过程中或者缺乏药物筛选压力的情况下，会造成基因拷贝数会丢失而使重组蛋白的表达水平下降等问题。另外，筛选获得高效稳定的高表达细胞株仍是一件费时费力的工作，这也成为制约哺乳动物细胞表达系统研发和生产的瓶颈之一。

除了上述因素外，细胞株所采用的培养工艺，储存方式等等都会对其稳定性产生影响，更多的还需要在实际的实验过程中不断的去探索以提高细胞株的稳定性。

3、增强细胞株稳定性的方法

业内一直在不断寻找可以增强细胞株的稳定性的方法，例如构建载体中使用无CpG的启动子，在构建载体中加入染色质开放UCOE来抑制目的基因沉默，和寻找理性整合位点（Hot Spot）来克服位置效应，或是开发新的基因扩增系统和寻找更高效的启动子来应对筛选过程中细胞株的不稳定性，等等。以这些方式为例，介绍以下三种增强细胞株稳定性的实验案例。

3.1、载体构建中加入染色质开放元件(UCOE)

有报道称将普遍存在的染色质开放元件(UCOE)纳入表达载体可增强CHO细胞系中的蛋白质产量并维持转基因表达稳定性。UCOE是建立和维持转录专一开放染色质结构功能的遗传控制元件,当UCOE序列在与某些启动子结合时，可以通过抑制启动子区DNA甲基化来克服转基因沉默。同时最近也有研究表明单抗的表达效率降低主要是由重链（HC）和轻链（LC）基因的转录沉默引起的，而重组基因拷贝没有丢失。DNA 甲基化，尤其是启动子 CpG 岛的甲基化，在转基因转录沉默中发挥着重要作用。据报道，使用顺式作用表观遗传调控元件，例如位点控制区（LCR）、基质附着区（MAR）和普遍存在的染色质开放元件（UCOE）可以保护转基因免受此类不良表观遗传事件的影响，在这些抗沉默元件中，将UCOE掺入表达载体可增强哺乳动物细胞中转基因的稳定性和表达水平。

基于这个理论，研究人员构建了LC和HC 的CMV区前都加入UCOE，仅在LC的CMV区前加入UCOE，仅在HC 的CMV区前加入UCOE和LC和HC都不加入UCOE四种质粒来验证UCOE抑制基因沉默的可行性以及添加UCOE的最优方式，如图1所示，用于稳转细胞株构建：

图1 构建和应用于研究的质粒载体结构示意图

稳转后通过长期筛选获得高表达的细胞池，对这些细胞池进行检测后得到如图2，3，4所示的结果:

图2 UCOE对稳定CHO细胞库中抗体表达水平的影响

图3 UCOE对抗体mRNA水平和基因拷贝数的影响

图4 UCOE对抗体表达稳定性的影响

结果表明，相对于常规（非UCOE）对照载体，将UCOE掺入抗体表达质粒载体中可以产生更高且更稳定的表达水平。在本研究中研究的三个包含稳定 UCOE 的池中，CHO-UHL 是最适合提高稳定抗体生产的系统。因此，得出的结论是，相对于HC和LC表达的增强，HC表达上调提供了更优化的表达条件。这里展示的新系统可以为工业细胞系开发方法提供重要的替代方案。

3.2、目的基因位点特异性整合（site specific integration）SSI

将目的基因整合到宿主细胞基因组的特定位置不仅能克服位置效应造成的表型异质性，还可以使重组细胞株的表达保持长期一致性和稳定性，同时很大程度上减少了细胞筛选时间。将目的基因精确地整合到CHO细胞特定的基因组区域，即可保证基因处于高效稳定转录的理想整合位点，这个位点被称为 Hot spot（图5）。Hot spot位点减少了克隆变异的几率，可确保细胞在长期培养中组蛋白质量的一致性和整体的高水平表达，并且还可以得到与随机整合相当的产量。

图5 目的基因整合到CHO细胞特定的基因组区域的结果显示

关于目的基因（GOI）位点特异性整合方法目前较为成熟分为：重组酶介导的位点特异性整合和核酸酶介导的位点特异性整合，关于这两种方法各有优缺点如图6所示：

图6 两种方法的优缺点比较

3.3、开发新的基因扩增系统

由于目前常用的基因扩增系统会产生染色体易位和同源重组，容易导致重组细胞产生不稳定的核型，在长期的培养过程中或者缺乏药物筛选压力的情况下，会造成基因拷贝数丢失而使重组蛋白的表达水平下降等问题。所以有研究人员开始着力于新的基因扩增系统的开发。

腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT) 是一种嘌呤代谢酶，是生物体内ATP合成的补救途径中催化腺嘌呤碱基转化为腺嘌呤核苷一磷酸 (AMP) 的关键酶。在哺乳动物中，aprt存在于所有组织中，并为多胺生物合成途径或饮食来源产生的腺嘌呤代谢进行补救。已有研究表明aprt不仅参与生物的合成代谢，还对基因沉默引起的基因表达具有重要的影响。Aprt对CHO细胞重组蛋白表达的作用研究尚未见报道。因此，研究人员敲除了CHO细胞中的aprt基因，筛选获得APRT缺陷型CHO细胞系；构建真核表达载体并转染APRT缺陷型和野生对照CHO细胞，研究aprt基因敲除对CHO细胞目的蛋白表达的影响，以期为最终建立新型高效CHO细胞基因扩增系统奠定理论和实验基础。

研究人员就此进行了瞬时转染和稳定转染得到的实验结果如下图所示：将构建的真核表达载体分别转染缺陷型和野生型CHO细胞，72 h后倒置荧光显微镜下观察瞬时转染及杀稻瘟菌素(blasticidin, BSD)筛选14 d后获得的稳定转染第一代CHO细胞中的EGFP荧光表达(图7A)，流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染CHO细胞EGFP的MFI (图7B、7C)结果显示：相比于野生型细胞，无论是转染对照载体还是弱化载体，APRT缺陷型CHO细胞中EGFP的表达均有明显提高：瞬时表达分别提高42%±6%和56%±9% (P< 0.05)，稳定转染第一代分别提高32%±4%和35%±6% (P<0.05)。

图7 瞬时转染和稳定转染的实验结果

野生型和APRT缺陷型多克隆细胞池经过60代传代培养后，倒置荧光显微镜观察EGFP荧光表达(图 8A)及流式细胞术检测EGFP的MFI (图 8B) 结果表明，与转染对照载体的野生型CHO细胞相比较，无论是否存在BSD加压(BSD+) 或不加压(BSD−)，转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP的表达量显著提高(P < 0.05)，分别提高2.02倍和1.53倍。通过计算CHO细胞的第60代EGFP的MFI与第1代EGFP的MFI的比值，比较重组蛋白长期表达维持率(低于70%)[25-27]。结果表明，转染对照载体的两组CHO细胞中EGFP表达稳定性明显下降；转染弱化载体的两组CHO细胞中EGFP表达维持率均高于70%，特别是APRT缺陷型CHO细胞中EGFP表达维持率最高。

图8 EGFP的荧光检测结果和流式细胞仪检测结果

该研究构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系的表达系统既能缩短稳定细胞株筛选周期，又能提升目的蛋白表达量的同时保持表达的稳定性。研究结果为CHO细胞表达平台的高质量和高生产率的发展提供了一种有效的细胞工程策略。