单克隆源性方法学验证
一轮有限稀释法或者单细胞铺板设备搭配单克隆成像设备。不同于概率计算和统计，这个方法可以提供单克隆源性的影像数据，但同时面临一定的挑战。需要考量细胞是否有黏连、是否沉底，落孔后细胞的位置。成像设备的孔位校准、微孔板底聚焦、光源、镜头位移、分辨率、边缘效应等都会影响图像的准确性和有效性。
单克隆源性方法学验证可以围绕以下几个方面进行：
1、细胞自然沉降工艺验证
采用明场成像，考察平台工艺的细胞在平台沉降时间内是否可以沉降，以及不同时间点沉降的效果。
2、离心沉降工艺验证
采用明场成像，考察平台工艺的细胞在平台离心条件下是否可以沉降，以及离心后不同时间点沉降的效果。
3、细胞识别验证
采用明场和荧光成像，考察成像设备对单克隆的识别能力。
4、单克隆铺板设备项目交叉验证
采用明场和荧光场成像，考察不同项目间单克隆铺板设备是否有细胞株交叉现象。
以单细胞铺板设备搭配成像设备为单克隆分选方法，有必要对单细胞铺板设备和成像设备进行单克隆源性方法学验证。考察单细胞铺板设备对单细胞的分辨能力和分选效率，通过验证过的细胞沉降方法，同样对单克隆成像设备进行细胞识别和交叉验证。同时验证和提高单细胞铺板和成像设备作为单细胞分选方法的单克隆源性可信度。
Genentech公司使用单细胞打印结合孔板成像的单细胞分选方法验证其分选的效率和单克隆源性的可信度。从单细胞铺板设备的分选图像可见，人工观察有95.9%的单细胞孔，2.6%的空细胞孔，1.5%的多细胞孔，多细胞孔由于图像对比度低，细胞落入ROI（Region of Interest）外圈区域，或是软件未能识别到黏连细胞导致存在假阳性孔现象。
对绿色和红色荧光的混合细胞群分选后的细胞使用成像设备进行拍照追踪，成像设备能识别到87.9%的单细胞孔，经过14天培养后，有9个孔为红绿混合细胞群，存在0.3%的假阳性单克隆率。因此对单细胞平台分选方法系统地验证单克隆源性，可以有效提高实验的可信度并能提供充分的单克隆源性验证数据，为在整个药物开发过程中提供很好的细胞株单克隆性起到重要的保障作用。
FDA审评专家在2019年对细胞株的单克隆源性提出了一些看法：单克隆源性验证是为了减少细胞库的异质性，保持生产过程的一致性和可预见性，确保最终产品的产量和质量在预设的范围内。单克隆源性如果有重大缺失和风险而影响产品质量的，需开展单克隆源性的控制策略研究，是整体控制策略的一部分。单克隆源性的验证主要是评估最终产品的安全性和有效性，单克隆源性不等于细胞株的遗传均一性等观点。进一步指出单克隆源性对产品的质量、安全性等有着很重要的作用。
单克隆源性中的probability和assurance概念的区别
Probability：使用数学方法计算单克隆的概率（比如泊松分布法）。Assurance：评估单克隆源性所需提供的资料，包括概率计算、补充文件和数据等。
而通常有以下几种单克隆源性情况是可以接受：High probability、Low probability + High Assurance、Low probability +Little Assurance +充分的控制评估策略。
单克隆源性assurance证据补充的分析方法
独特的遗传学特征（质粒整合位点，质粒重排等）是独一无二的，一般不受CHO细胞可塑性影响，可以作为单克隆源性证据。通常有以下几个质粒整合位点的分析方法：
01、荧光原位杂交技术（FISH）：在染色体层面观察整合位点，不需要获得整合位点序列，可以直接可视化检验DNA在染色体上的位置和均一性。并且原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响，已经成为重复序列和多基因家族作图的重要手段。但是容易受到染色体重排影响并且低拷贝数位点的灵敏度高。
02、Southern Blot：kb级DNA检测水平，其产生的条带对于每一个整合位点都是独特的，不需要获得整合位点序列，也不容易受到染色体重排的影响。但是工作量大，分辨率不高，会受到整合位点附件序列重排的影响。
03、Junction PCR：bp级DNA检测水平，通过NGS或者传统方法（inverse PCR、splinkerette-PCR或LAM-PCR）获得基因整合位点的临界序列，再用Junction PCR扩增临界序列以确定独特整合位点的存在。此方法不易受突变和重排的影响，但是需要亚克隆以及获得整合位点的序列。
04、下一代测序技术（Next-Generation Sequencing Technology，NGS）：该方法可直接用于整合位点的单克隆源性的鉴定，不一定需要大量亚克隆，但是操作分析比较繁琐，耗时长，有些位点可能会遗漏。
单克隆源性的控制策略（Control Strategy，CS）
非单克隆细胞系的控制策略取决于产品及其应用。常规的一些控制策略包括但不局限于：额外的检测手段，如LC-MS检测序列变异度，糖基化水平等；超过体外细胞限定代次的全面系统评估；增加更多的关键工艺参数；工艺过程控制的趋势统计；对重要原材料变更的风险评估；严格控制及全面鉴定新建立的细胞库等。
总结
单克隆源性是生物药生产过程中整体控制策略的一部分，对产品的安全、有效性起到至关重要的作用。单克隆源性验证是为了减少细胞库的异质性，保证生产过程的一致性和可预见性，确保最终产品的产量和质量在预设的范围内。建议尽早从细胞株筛选阶段做好单克隆性工作，减少后续的药物开发风险。
