细胞株在药物开发过程中的重要性

细胞株在整个重组蛋白药物开发过程中的地位可谓举足轻重，起着承上启下的重要作用。通过药物早期发现和筛选确定候选分子后即开始CMC阶段的细胞株开发工作，细胞株是CMC阶段药物工艺开发的起点。细胞株的质量和产量直接影响产品的安全性、有效性和成本。

一株好的细胞株需要满足表达量高、质量优、表型和基因型稳定、易放大且符合单克隆源性等多个指标。而细胞株的单克隆源性也是近年来监管机构和企业越来越关注的方面。

什么是单克隆源性？

用于商业化生产的工程细胞株需要来源于单一原始细胞。

国内和国际法规对单克隆源性的要求

《中国药典2020年版》——生物制品生产检定用动物基质制备及质量控制

1、细胞系建立

在细胞克隆过程中，应选择单个细胞用于扩增，详细记录克隆过程，并根据整合的重组DNA的稳定性、细胞基因组及表型的稳定性、生长速率、目的产物表达水平和完整性及稳定性，筛选具有分泌目的蛋白最佳特性的候选克隆，用于建立细胞种子。

2、细胞种子

由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。

ICH Q5D

For recombinant products, the cell substrate is the transfected cell containing the desired sequences, which has been cloned from a single cell progenitor.

(US) FDA points to consider in the characterization of cell lines used to produce biologics (1993)

The MCB is defined as a collection of cells of uniform composition derived from a single tissue or cell.
EMA/CHMP Guidance on development, production, characterization and specifications for monoclonal antibodies and related products (2008)

The cell substrate to be used for the production of the monoclonal antibodies should be a stable and continuous monoclonal cell line that has been developed by means of recombinant DNA and / or other suitable technologies.

23 June 2016, EMA/CHMP/BWP/534898/2008 rev. 1, Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP)

Information on the generation, qualification and storage of the cell banks is required. The MCB and/or WCB if used should be characterized and results of tests performed should be provided. Clonality of the cell banks should be addressed for mammalian cell lines. The generation and characterization of the cell banks should be performed in accordance with principles of ICH Q5D.

单克隆分选技术

随着技术的迭代更新，分选单细胞不仅仅局限于传统的有限稀释法，许多新型的单克隆分选设备和技术的出现助力药物开发更快、更高效地进行单克隆化及挑选优质的生产用克隆。以下展示应用较广的单克隆分选技术的优缺点：

1. 有限稀释法（limiting dilution cloning, LDC）：一种通过梯度稀释以获得单克隆的方法。经统计学计算, 每孔细胞数X服从常数为λ的泊松分布: P(X=k)=λk*e–λ/k!，λ表示每孔细胞数的均值，P表示每孔细胞数为k的概率。两轮有限稀释单克隆率：P2=P1+(1-P1)*P1。两轮有限稀释，根据泊松分布的原理计算，按照低于0.5 cells/well进行两轮有限稀释，理论单克隆率在95%以上。但是有限稀释法得到的单克隆是没办法证明为单克隆的，只能推定为单克隆。

2. 半固体培养法：将细胞以低密度接种在半固体培养基（琼脂、甲基纤维素等）中，当细胞生长成分离的集落后，采用手工或自动化挑取设备进行克隆的挑取。半固体培养基不仅可以固定细胞以形成可区分的集落, 也能将分泌蛋白保留在细胞附近。

单克隆率=[1–0.25×π×(d1+d2) 2 ×(n–1)/(0.25×π×D2 )]×100%, 其中, d1和d2分别为两个挑取克隆群落的直径，n为克隆个数，D为培养孔的直径。但是一轮ClonePix挑选只是统计学上计算单克隆率，单克隆源性有风险，需增加一轮有限稀释和细胞成像。

3. 流式细胞术和细胞分选联用方法：将待测的细胞经荧光染料(FITC、PE等)或荧光标记物特异性染色, 用特定波长的激光束照射，激发荧光。前向角光散射(forward angle light scatter, FSC)和侧向角光散射(side angle light scatter, SSC)分别表征细胞的相对大小和内部颗粒度，相对荧光强度值能反映细胞目标的相对表达水平。

（1）凝胶微粒（gel microdrop, GMD）和流式细胞术结合的方法可以快速检测细胞群中单个细胞的蛋白分泌情况。由于GMD的渗透性好，小部分分子可能会分泌到邻近的GMD中，导致出现假阳性结果。根据泊松分布制备的GMD中，单细胞率只有10%-15%。

（2）亲和捕获表面展示(affinity capture surface display, ACSD)利用生物素和亲和素的结合，将分泌分子捕获在细胞表面，利用荧光标记试剂结合FACS技术对单细胞的分泌情况进行直接的定量检测。ACSD用的是含10%明胶的高黏度培养基，能将分泌产物阻留在细胞表面，不会出现假阳性现象。

（3）低温捕获法：单个细胞表面的蛋白含量与细胞分泌的蛋白数量有着显著的相关性。在较低的温度（如4℃）下用荧光标记的试剂直接对细胞膜染色，表面荧光强度很稳定，可以作为筛选单细胞蛋白分泌的情况。然而不是所有细胞的表面蛋白含量和分泌量都具有显著的相关性, 且该方法对细胞的蛋白传递能力有严格的要求，细胞膜表面的蛋白含量需要达到一定水平才能保证检测的准确度。

（4）荧光蛋白共表达：GFP或其衍生物的基因和目的基因一起编入双顺反子表达载体, GFP的荧光强度与表达量成良好的线性关系。GFP的表达量间接反映了目的蛋白的表达量。

通常也可以使用分选型流式细胞仪直接分选单克隆，分选条件需要进行优化，分选后的单克隆需要搭配单克隆拍照设备记录单细胞生长过程。

4. 微流控分选技术：单细胞流在微流控通道中流过激光检测区域，通过高分辨率光学系统和软件算法识别单细胞，也存在多个或空细胞，单克隆率往往有80-90%以上，同样需要借助单克隆拍照设备。

5. Beacon光电定位系统：单细胞光导系统通过光电定位技术和微流控技术，实现细胞的分选、培养、检测和输出的功能，单克隆率往往大于90%以上。

参考文献

1. Poisson Statistical Analysis of Repetitive Subcloning by the Limiting Dilution Technique as a Way of Assessing Hybridoma Monoclonality. DOI: 10.1016/0076-6879(86)21039-3.

2. 生产用重组哺乳动物细胞株的克隆筛选方法DOI: 10.11844/cjcb.2015.05.0044

3. The selection of high-producing cell lines using flow cytometry and cell sorting.Carroll S, Al-Rubeai M.Expert Opin Biol Ther. 2004 Nov;4(11):1821-9. doi: 10.1517/14712598.4.11.1821.

4. A Novel Mammalian Cell Line Development Platform utilizing Nanofluidics and OptoElectro Positioning (OEP) technology .DOI 10.1002/btpr.2690