毕赤酵母（Pichia Pastoris）是一种甲醇营养型酵母菌。它于1960年代被发现，其特征是将甲醇作为且是唯一的碳和能量的来源。经过多年研究，毕赤酵母被广泛用于生物化学研究和生物技术行业，正在逐渐成为一种重要的重组蛋白表达生产系统。虽然毕赤酵母的应用历史和名望远不及上千年前就被人类发现的酿酒酵母，不过相比酿酒酵母，毕赤酵母优越的性能使其在生物制药中的应用正在逐步超过酿酒酵母。下表是FDA审批的部分应用酵母表达的生物制品清单，涉及激素、疫苗、血液相关制品、细胞因子和酶等。
FDA-approved biopharmaceuticals produced in yeast cells (adapted from Walsh, 2018).[1]
起初酿酒酵母也被生物制药界寄予厚望，希望这一真核微生物能够拥有媲美大肠杆菌的重组蛋白产量和生产成本，还拥有翻译后修饰如糖基化、更好的折叠、分泌系统等真核细胞的体系。不过“理想很丰满、现实很骨感”，酿酒酵母表达系统应用于制药，最初的发展并不顺利，并且一度给整个酵母在生物制药中的发展留下了阴影，以至于酵母在生物制药中的应用在20世纪80年代才开始缓慢起步。
最初酵母重组表达在生物制药中不顺利主要是由于以下一些问题。最初应用酿酒酵母表达的几个重组蛋白结果不太理想，同时酿酒酵母的摇瓶工艺到发酵工艺的放大技术转移大多也都不理想。此外酿酒酵母的N连接-糖基化与哺乳动物细胞有很大差异，酵母将甘露糖引入到糖基化中，长度可以达到50~150，长度差异性或异质性很大，且糖链的核心寡糖含有α-1,3糖苷键。甘露糖侧链和α-1,3糖苷键糖链在人体内都会引起排异反应，会导致制品血清半衰期明显缩短，更重要的是给制品的生物安全性带来巨大隐患。
Major N-glycosylation pathways in humans and yeast.[2]
不过随着20世纪70年代以来分子生物学技术的快速突破和发展，人们也自然想到了通过遗传改造优化酵母的糖基化类型和方式，将糖基化进行人源化改造，这也是优化酵母重组表达系统的一个方向。
同时，人们把目光投向了新的酵母菌株，此时毕赤酵母以拥有众多生物表达系统的优点脱颖而出。
1. 和酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面具有优势。酿酒酵母与毕赤酵母不同，N-连接糖基化主要是高甘露糖形式。酿酒酵母侧链寡糖通常会添加50~150个甘露糖残基，长度差别很大，修饰后的蛋白异质性高；相比而言，毕赤酵母平均每条侧链为8-14个甘露糖残基，长度变化小，修饰后的蛋白一致性高。而且毕赤酵母不产生具有免疫原性的α-1,3糖苷键，所表达的生物制品安全性更好。
2. 和酿酒酵母相比，毕赤酵母在表达调控上拥有明显优势。作为甲醇营养型酵母，毕赤酵母可以使用AOX1启动子表达外源蛋白，这是一种非常严谨控制的高表达诱导体系，不会存在表达泄露问题，同时表达水平也很高，能比酿酒酵母高10~100倍，简直媲美大肠杆菌表达系统。此外还含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP）启动子，用于高水平的组成型表达。酿酒酵母表达载体是以质粒形式，毕赤酵母则以整合进入基因组的方式，菌株表达稳定性高、可靠性强。
3. 和其它物种的表达系统相比，毕赤酵母的优势同样明显，其兼具原核表达系统和真核表达系统的优点。与最常用的E.coli和CHO表达系统相比，其具体对比如下表：
Basic characteristics of different host systems for the expression of recombinant proteins.[3]
由上表可知，虽然在单独对比中E.coli和CHO表达系统都比毕赤酵母有一些优势，但总体比较而言，毕赤酵母具备了微生物的培养简单经济、支持高密度发酵、表达量高的优点，同时具备了哺乳动物细胞的蛋白翻译后修饰、正确折叠、分泌表达等优势。综上，毕赤酵母的优势是：培养简单经济、具备折叠和翻译后修饰、表达产量高、产物避免了内毒素和病毒污染等。
4. 和CHO细胞表达平台的基因组整合表达一样，毕赤酵母同样可以应用加压筛选进行多拷贝重组子的筛选和工程菌株建库，不过毕赤酵母通过单交叉串联重组到酵母染色体的单一固定位点，生产用细胞株的遗传稳定性更好。
那么常用的毕赤酵母有哪些呢？接下来我们按照突变体类型进行划分，毕赤酵母含有AOX1和AOX2两个醇氧化酶基因，也正是由于此两个基因的存在使得毕赤酵母能够以甲醇做为营养和能量物质，不过AOX1产物酶活高起主要功能，AOX2产物酶活低。当AOX1突变后，毕赤酵母虽然也可以在含甲醇培养基中生长，不过生长速率下降很多。因此对于不同的AOX1和AOX2基因型，可将酵母菌株分为Mut+（含有AOX1和AOX2）、MutS（敲除AOX1，保留AOX2）和Mut-（敲除AOX1和AOX2）。常用的毕赤酵母菌株的Mut分型如下：
毕赤酵母既可以表达分泌蛋白，也可表达胞内蛋白，而被广泛应用于亚单位疫苗的表达制备。近年来的进展情况见下方三个表格，表中描述了表达载体、Marker基因、表达菌株和目的蛋白等信息。
Common Pichia pastoris expression vectors for the production of secretory proteins.[3]
Common Pichia pastoris expression vectors for the production of intracellular proteins.[3]
Recombinant subunit vaccine expressed in Pichia pastoris.[3]
2020年2月21日，FDA批准丹麦灵北制药的CGRP抗体Eptinezumab上市，商品名为Vyepti，用于预防偏头痛。Eptinezumab是通过重组DNA技术在毕赤酵母细胞中表达而得，是首个酵母表达的单抗药物。这项工作为酵母在抗体生产中的应用和抗体药物生产成本控制打开一片新的蓝海。在医药企业竞争激烈、产品同质化严重、国家药物集采的背景下，提高药品研发成功率、降低药品生产成本、提高公司核心竞争力，都是医药公司面临的难题。随着毕赤酵母表达系统的完善和成熟，其生产成本低、发酵周期短、易于培养、操作简单方便、可大规模生产、基因遗传稳定，蛋白翻译后修饰等特点，受到越来越多研究机构和医药生产企业的青睐。
✦ 上海领康时代酵母表达平台
公司建有毕赤酵母、酿酒酵母重组蛋白表达平台，可实现从Gene到IND，以及早期临床样品制备的全流程开发服务，开发周期9-15个月。建设有符合GMP要求的1条500L微生物发酵和纯化的成熟生产线，可提供10L-50L、500L等规模的原液制备。
领康时代酵母表达平台工作流程图
参考文献
[1] Yeasts as Biopharmaceutical Production Platforms. Front Fungal Biol. 2021.
[2] The humanization of N-glycosylation pathways in yeast. Nat Rev microbiol. 2005; 3(2): 119-28.
[3] Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins. J Cell Physiol. 2020; 235(9): 5867-5881.
撰文：LKTime-上游事业部
