从已获批的抗体药物分析发现，成药性相关的研究内容是以始为终的。图5总结了在美国、欧洲、日本和中国获批的129种抗体药物的浓度和给药途径，发现考虑到对应的疾病指征、浓度和给药途径，每类抗体药物的成药性标准各不相同。

从图2中可以获悉不同阶段中的成药性分析相关属性，以及用于评估成药性相关属性的实验分析。

01.  靶点评估阶段，需要考虑治疗用抗体的临床使用情况，例如治疗眼部疾病的抗体药物往往采用小剂量玻璃体腔内注射，所以抗体药物需要高溶解度和低黏度。

02.  抗体生产和优化阶段，通过抗原结合活性和生物功能筛选出候选抗体，然后进行少量抗体（＜1mg）的表达和纯化。此阶段中，应该检测外观、表达水平、产量、纯度和与靶点同源物的结合力均应被检测。

在生产和使用抗体的整个过程中，各阶段的外观现象均应被观察，包括细胞培养、培养上清的收集、纯化、浓缩、储存、冻融以及稀释的过程中。带有可见颗粒或者沉淀的抗体均要注意，可能需要进一步优化。

抗体的表达水平可以通过蛋白A色谱或者蛋白A亲和纯化实验进行检测。一般情况下，Expi293瞬时表达得到100mg/l的mAbs是可以接受的。正常水平下，抗体纯度＞90%时可以进行大部分体外实验，尽管一些分析需要更的体纯度以避免杂质影响。颗粒、聚集、低表达、低纯度或者低结合力的出现都可能是发生成药性问题的警告信号。当获得抗体序列后，计算机分析出抗体的PTM位点，通常是特定部位的一些残基，去除或者增加的一段序列。

抗体会继续被加工满足项目需求，如抗体人源化、亲和力成熟、Fc工程改造等。此阶段中，除监控外观、表达水平和纯度外，具有高风险的翻译后修饰位点应该被去除，同时进行热稳定性分析。高风险的motifs，包括NG/NS/DG motifs、多余的半胱氨酸残基、可变区域的N端糖基化motif，均应被去除，减轻对抗体药物有效性和安全性的风险。一旦在临床前阶段鉴定出部分候选抗体，我们建议检查溶解度相关的属性以及更多的非特异性结合能力。

03. BsAb或者ADC阶段，一个mAb通过linker与有效载荷偶联形成ADCs，有效载荷、linker和偶联均可能改变mAb的构象。有效载荷的疏水性和电荷分布不均可能会触发ADCs的聚集。所以一旦偶联，需要重新检测ADCs的纯度、产量和药物-抗体比，特别注意高分子量片段的百分比。经过几轮冻融后ADCs的稳定性也需要被检测，观察裂解下来的有效载荷百分比。

BsAb通常由一对针对不同靶点的亲本抗体组装而成。由于亲本抗体可变区域的物理化学属性会转移到bsAb上，强烈建议在构造和优化bsAb之前，先对亲本抗体进行优化。BsAbs也应该被检测外观、表达、纯度、热稳定性等。在bsAbs工程化过程中，应用计算机分析避免增加的PTM位点。

对于有潜在成药性风险的候选抗体而言，应采取一些措施。带有轻微颗粒或沉淀的抗体分子可以在不同的制剂缓冲液中进行检测。对于有严重成药性风险的候选抗体，比如连续聚集、差稳定性、预期之外的低溶解度或显著的非特异性结合，都有必要重新设计抗体序列。


同质性：

抗体是由活细胞培养出的，所以抗体来源药物不可能与化学合成小分子药物一样具有一样的同质性。ICH（Q6B）表明应该将生产过程相关杂质和某些产品相关杂质水平降低到一个可接受的水平。生产过程相关杂质包括细胞基质（如宿主蛋白、宿主DNA）、细胞培养成分（如诱导剂、抗生素或者培养基成分）、下游工艺底物。产品相关杂质（如前体、某些降解产物）是在生产和/或加工过程中产生的分子变体，这些分子变体在活性、有效性和安全性方面与目标产物相差较远。在发现阶段，产品相关杂质是成药性评估和优化的主要考虑点。比如抗体链发生未配对、丢失或错配，抗体N端、铰链区、恒定区或者C端发生断裂，生产过程甚至给药过程中发生的多种修饰（半胱氨酸相关修饰、N端修饰、天冬酰胺脱氨基、天冬氨酸异构化、糖基化、氧化等），抗体聚集等。

稳定性：

稳定性是治疗性候选抗体发现和开发阶段一个非常重要的因素，包括热稳定性、光照敏感稳定性、pH敏感稳定性、物理应激相关的稳定性和冻融稳定性等等。 

蛋白在高温或遇到化学变性剂时会发生去折叠，失去其高级结构，从而失去活性。通常使用差示扫描量热法（DSC）或差示扫描荧光法（DSF）对蛋白溶液进行梯度升温，来检测热变性温度（Tm），以反映其构象的热稳定性。

完整折叠的蛋白在溶液中会有自身相互作用，这种作用力主要由折叠后分子表面的疏水基团和电荷分布决定。当自身相互作用力表现为排斥力时，溶液就会表现出相对较好的胶体稳定性；而如果主要为吸引力时，就会容易产生聚集甚至沉淀，或表现为溶液粘度的增加。

溶解度和黏度：

溶解度是候选抗体物成药性评估中一项很重要的参数，和抗体的自身相互作用呈负相关性，这些自身相互作用主要包括疏水作用、范德华力、氢键和静电相互作用，可以通过检测抗体的三维结构（如Fab-Fab互作）或者溶液属性（如缓冲液成分、pH值、温度、盐浓度、辅料等）得到。低溶解度通常会引起抗体高黏度、非靶向结合和快速清除。

特异性：

抗体的抗原结合位点包含三个（VHH）或六个（Fab）CDR环，通过非共价键结合到特异性的抗原表位上，诸如氢键、疏水作用、范德华力以及静电力。一个表征良好的抗体应具备对单一靶点的敏锐的特异性，但并不是所有抗体都具有这一特性。不平衡的正电荷分布或者可变区域的超疏水性都有可能导致非特异性结合，从而造成抗体的药代动力学（PK）结果较差、生物活性降低、严重的副作用。

发现阶段的成药性评估通常快速高通量，样品消耗量小（微克到几毫克），主要包括表达水平、产量、纯度、同质性、稳定性、溶解度和特异性等内容。目前计算机预测已被广泛用于评估成药性的相关属性，譬如化学稳定性、折叠能和表面胶体性质。计算机模拟方法通过在大量数据库中检测抗体序列和结构的数据，获得训练模型然后预测出关键属性。



mAbs、bsAbs和ADCs已经成为重要的治疗性药物。有效抗体发现过程中，有必要对主要候选物的与生物学和成药性相关的参数进行仔细检测，而对主要候选物的成药性筛选和优化进程已经被提前到了药物发现的早期阶段，这个阶段的成药性评估往往消耗消耗测试样本较少，可高通量筛选出几十到几百个候选抗体。计算机模拟工具也会被用于设计、预测、筛选和优化候选抗体的成药性，比如alphaFold以及其他的一些人工智能工具已经在蛋白结构预测方面显示出很高的精确度。另外，深度学习模型也可以用于从头设计带有预期属性的蛋白，诸如亲和力、溶解度以及稳定性等。这些高精度、多重的计算机模型可以显著减少湿实验并加快生物药的开发。

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参考文献

[1] Developability assessment at early-stage discovery to enable development of antibody-derived therapeutics. Antib Ther. 2022; 6(1): 13-29.